Name: protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00
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इस अध्ययन को बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 7202119) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 82274380) द्वारा समर्थित किया गया था।

प्रयोग बीजिंग यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन, चीन में फिजियोलॉजी की प्रयोगशाला में किए गए थे। सभी अध्ययन विधियों को बीजिंग विश्वविद्यालय के प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया था।</p...

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+supported+by+exogenous+cytochrome+c+oxidation+mimics+the+early+stages+of+apoptosis.">Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).</li><li>De Filippo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+secondary+prevention+medical+therapies+on+outcomes+of+patients+suffering+from+Myocardial+Infarction+with+NonObstructive+Coronary+Artery+disease+(MINOCA):+A+meta-analysis.">Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis.</a> International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).</li><li>Davidson, S. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+on+outcome+of+5284+patients+with+coronary+artery+disease:+the+role+of+integrative+medicine.">Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine.</a> Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crocetin+ester+improves+myocardial+ischemia+via+Rho/ROCK/NF-kappaB+pathway.">Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway.</a> International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting.">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).</li><li>Zeng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+potential+value+and+mechanism+of+Kaji-Ichigoside+F1+on+arsenite-induced+skin+cell+senescence.">Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+JC-1.">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li><li>Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+apoptosis+by+TUNEL+assay.">Detection of apoptosis by TUNEL assay.</a> Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+impairs+the+autophagic+flux+to+induce+p62-dependent+apoptosis+through+the+upregulation+of+CYLD+in+NRCMs.">Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs.</a> Toxicology. 465, 153032 (2022).</li><li>Kurien, B. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+perspective+and+opportunities+in+pharmacologically+important+safflower.">A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower.</a> Metabolites. 10 (6), 253 (2020).</li><li>Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+saffron+supplementation:+current+clinical+findings.">Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+protective+effect+of+salidroside+against+H2O2-induced+injury+in+H9C2+cells.">Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).</li><li>Chen, G. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+PINK1.">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li><li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1/Parkin+mitophagy.">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li><li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SQSTM1/p62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN/parkin+in+mitophagy.">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li></ol>

उन्नत प्रौद्योगिकी के माध्यम से प्राकृतिक दवाओं के जटिल यौगिकों से प्रभावी अवयवों की खोज टीसीएम अनुसंधानका एक हॉटस्पॉट रहा है, और सत्यापन के बाद भविष्य की दवा के विकास के लिए प्रयोगशाला साक्...

तीव्र मायोकार्डियल रोधगलन (एएमआई) एक जानलेवा मायोकार्डियल नेक्रोसिस है जो गंभीर और लगातार इस्किमिया और कोरोनरी धमनियों में हाइपोक्सिया के कारण होता है। पर्क्यूटेनियस कोरोनरी इंटरवेंशन (पीसीआई) एएमआई के लिए पहली पंक्ति की चिकित्सीय रणनीतियों में से एक है, और आमतौर पर कार्डियोमायोसाइट्स को इस्केमिक क्षति 3,4 से बचाता है। डिस्टल मायोकार्डियम में रक्त और ऑक्सीजन की आपूर्ति की कमी होगी यदि एएमआई के बाद तुरंत और प्रभावी ढंग से इलाज नहीं किया जाता है, जिससे इस्केमिक नेक्रोसिस और आगे कार्डियोवैस्कुलर जटिलताएं 5,6 हो जाती हैं। कार्डियोमायोसाइट्स रिकवरी को बढ़ावा देना और पीसीआई सर्जिकल अवसर से चूकने के बाद अपरिवर्तनीय मायोकार्डियल क्षति को कम करना एक शोध हॉटस्पॉट रहा है। एएमआई के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स इस्किमिया और हाइपोक्सिया की स्थिति में होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का निषेध, एनएडी + से एनएडीपीएच में कमी और एकल इलेक्ट्रॉन कमीमें वृद्धि होती है। नतीजतन, ऑक्सीजन की अपूर्ण कमी प्रतिक्रिया प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की अधिकता उत्पन्न करती है और अंततः कार्डियोमायोसाइट्सको ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति की ओर ले जाती है। आरओएस का अत्यधिक संचय लिपिड पेरोक्सीडेशन को ट्रिगर करता है, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की संरचना और कार्य को और बाधित करता है। परिणाम माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्रों का निरंतर उद्घाटन और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में कमी है, जो एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस को प्रेरित करता है।
एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम (एसीई) इनहिबिटर, एंजियोटेंसिन-रिसेप्टर ब्लॉकर्स (एआरबी), एएमआई में β-एड्रेनोसेप्टर्स, एल्डोस्टेरोन विरोधी और अन्य मानक दवाओं के अवरोधक मायोकार्डियल रोधगलन के बाद हृदय समारोह को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं और घातक घटनाओं की घटना को रोक सकते हैं, जैसे कि अतालता और बाएं वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग9। हालांकि, पोस्टरोधगलन अस्तित्व और रोग का निदान इन्फ्रैक्ट आकार से बहुत प्रभावित होता है, और कार्डियोमायोसाइट्स एपोप्टोसिस10,11 को कम करने के लिए संतोषजनक परिणाम प्राप्त नहीं किए गए हैं। इस प्रकार, मायोकार्डियल रोधगलन के बाद कार्डियोमायोसाइट्स वसूली को बढ़ावा देने के लिए दवाओं का विकास एक जरूरी मुद्दा बन गया है।
पारंपरिक चिकित्सा कई वर्षों से आधुनिक दवा अनुसंधान के लिए प्रेरणा का स्रोत रही है12,13,14,15। पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) का एएमआई के उपचार में एक लंबा इतिहास है, और हाल के वर्षों में यादृच्छिक नियंत्रण परीक्षणों की एक श्रृंखला ने पुष्टि की है कि टीसीएम वास्तवमें रोगियों के पूर्वानुमान में सुधार कर सकता है। टीसीएम सिद्धांत के अनुसार, एएमआई रक्त ठहराव18,19 के कारण होता है, इसलिए रक्त परिसंचरण को बढ़ावा देने के लिए दवाओं का उपयोग आमतौर पर तीव्र चरण20 में एएमआई के उपचार के लिए किया जाता है। उनमें से, केसर को रक्त सक्रियण और ठहराव पर एक शक्तिशाली प्रभाव माना जाता है, और अक्सर एएमआई के तीव्र उपचार में उपयोग किया जाता है। क्रोसेटिन, केसर का एक प्रमुख घटक, कार्डियोमायोसाइट्स21 की रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।
इस अध्ययन में, एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाओं को एच 2ओ2 द्वारा मायोकार्डियल इस्किमिया / रीपरफ्यूजन का अनुकरण करने के लिए प्रेरित किया गया था, जो एएमआई की कार्डियोमायोसाइट चोट का कारण बनता है, और क्रोसेटिन का उपयोग ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित मायोकार्डियल चोट के खिलाफ इसके सुरक्षात्मक प्रभाव की जांच के लिए एक हस्तक्षेप के रूप में किया गया था। कार्डियोमायोसाइट्स की रक्षा करने वाले क्रोसेटिन के तंत्र को माइटोफैगी के माध्यम से आगे खोजा गया था। इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह लेख माइटोफैगी के अध्ययन के लिए तकनीकी दृष्टिकोण के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है और पूरी प्रयोगात्मक प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2323363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x protein loading buffer</td>
			<td>Beijing Pulilai Gene Technology</td>
			<td>B1030-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free blocking solution</td>
			<td>CST</td>
			<td>15019s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parkin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PINK1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A11435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TOM20 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A19403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin&#160; antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>KeyGEN Biotech</td>
			<td>KGP902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood cell counting plate</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>WG607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAT assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A007-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A032-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme Q10 (CoQ 10)</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>C6129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocetin</td>
			<td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>RFS-Z01802006012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-containing antifluorescence quenching tablets</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFH-DA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>P10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7.0&#160;</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-Px assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A005-1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 myocardial cells</td>
			<td>Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CS0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>J22202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A020-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A003-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A2114057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perhydrol</td>
			<td>G-clone</td>
			<td>CS7730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gels</td>
			<td>Shanghai Epizyme Biomedical Technology</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE transfer buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2017-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOD assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A001-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLCC9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL apoptosis assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy

इस अध्ययन का उद्देश्य इन विट्रो प्रयोगों के माध्यम से एच 2 ओ 2-मध्यस्थता एच 9सी2 मायोकार्डियल कोशिकाओं पर क्रोसेटिन के ऑक्सीडेटिव तनाव-सुरक्षात्मक प्रभाव का पता लगाना था, और आगे यह पता लगाना था कि क्या इसका तंत्र माइटोफैगी के प्रभाव से संबंधित है। इस अध्ययन का उद्देश्य कार्डियोमायोसाइट्स में ऑक्सीडेटिव तनाव पर कुसुम एसिड के चिकित्सीय प्रभाव को प्रदर्शित करना और यह पता लगाना है कि क्या इसका तंत्र माइटोफैगी के प्रभाव से संबंधित है। यहां, एक एच 2 ओ2-आधारितऑक्सीडेटिव तनाव मॉडल का निर्माण किया गया था और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच), क्रिएटिन काइनेज (सीके), मालोंडिएल्डिहाइड (एमडीए), सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी), कैटलेस (कैट), और ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीएसएच पीएक्स) के स्तर का पता लगाकर कार्डियोमायोसाइट्स के ऑक्सीडेटिव तनाव की चोट की डिग्री का आकलन किया गया था। माइटोकॉन्ड्रियल क्षति और एपोप्टोसिस का आकलन करने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) -फ्लोरोसेंट डाई डीसीएफएच-डीए, जेसी -1 डाई और ट्यूनल डाई का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया था। ऑटोफैजिक फ्लक्स को एड-एमचेरी-जीएफपी-एलसी 3 बी एडेनोवायरस को स्थानांतरित करके मापा गया था। माइटोफैगी से संबंधित प्रोटीन का पता तब पश्चिमी सोख्ता और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से लगाया गया था। हालांकि, क्रोसेटिन (0.1-10 μM) सेल व्यवहार्यता में काफी सुधार कर सकता है और एच 2 ओ2के कारण एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति को कम कर सकताहै। अत्यधिक ऑटोफैजिक सक्रियण वाली कोशिकाओं में, क्रोसेटिन ऑटोफैगी प्रवाह और माइटोफैगी से संबंधित प्रोटीन पिंक 1 और पार्किन की अभिव्यक्ति को भी कम कर सकता है, और पार्किन के माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानांतरण को उलट सकता है। क्रोसेटिन एच 2 ओ 2-मध्यस्थता ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति और एच 9 सी2कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को कम कर सकता है, और इसका तंत्र माइटोफैगी से निकटता से संबंधित था।

सेल व्यवहार्यता पर क्रोसेटिन के प्रभाव 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, और 100 μM पर क्रोसेटिन का कोशिकाओं पर एक महत्वपूर्ण प्रोलिफेरेटिव प्रभाव था, जबकि 200 μM से ऊपर सांद्रता पर क्रोसेटिन ने H9c2 कोशिकाओं के प्रसा?...

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Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

इन विट्रो प्रयोगों के आधार पर, इस अध्ययन ने माइटोफैगी को प्रभावित करके कार्डियोमायोसाइट्स के ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति की मरम्मत में क्रोसेटिन के तंत्र का खुलासा किया, जिसमें पिंक 1 / पार्किन सिग्नलिंग मार्ग एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

पार्किन पाथवे-मध्यस्थता मिटोफैगी के माध्यम से क्रोसेटिन द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव से एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाओं का संरक्षण

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

यह प्रोटोकॉल ऑटोफेज के अध्ययन के लिए तकनीक दृष्टिकोण के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है और यह विस्तार से संपूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह ऑटोफैजिक फ्लक्स में परिवर्तन की लंबाई अवलोकन की अनुमति देता है। प्रयोग शुरू करने से पहले, प्रभावी संक्रमण एकाग्रता निर्धारित करें और आवश्यक सुरक्षा उपाय करें।कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 179 जी पर बेअसर एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करके शुरू करें। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और कोशिकाओं को डीएमईएम पूर्ण माध्यम में धीरे-धीरे उड़ाकर मिलाएं। कोशिकाओं को नौ समान अनुपात में विभाजित करें।नियंत्रण समूह में डाइमिथाइल सल्फोक्साइड जोड़ें। फिर, शेष समूहों में क्रोसेटिन की अलग-अलग सांद्रता जोड़ें। 96-वेल प्लेट में प्रति कुएं 100 माइक्रोलीटर कोशिकाओं को बीज दें।एक बार 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करने के बाद, सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। फिर, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। प्रत्येक कुएं में डीएमईएम बेसल माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर चार घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।अब, एमटीएस के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्रदर्शित के अनुसार अगले दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। अंत में, 490 नैनोमीटर पर अवशोषण को मापें और सेल व्यवहार्यता की गणना करें। आरओएस निर्धारित करने के लिए, सीरम-मुक्त माध्यम के साथ 1: 1000 अनुपात में डीसीएफएच-डीए को पतला करें।सेल के सुपरनैटेंट को 48-वेल प्लेट से हटा दें, जिसे पहले एच 9 सी 2 कोशिकाओं के साथ बीज दिया गया था। फिर, सीरम-मुक्त माध्यम से कोशिकाओं को दो बार धोएं। प्रत्येक कुएं में 150 माइक्रोलीटर पतला डीसीएफएच-डीए जोड़ें और इसे 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इसके बाद, सीरम-मुक्त माध्यम से कोशिकाओं को तीन बार धोएं। अंत में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करें। माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का विश्लेषण करने के लिए, पहले से सुसंस्कृत कोशिकाओं में जेसी -1 कामकाजी समाधान जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।उन्हें 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, जेसी -1 धुंधला बफर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें। प्रत्येक कुएं में पूर्ण माध्यम जोड़ें और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके तस्वीरें कैप्चर करें।कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेल निर्धारण समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। फिर, उन्हें एक बार पीबीएस से धो लें। प्रत्येक कुएं में 0.3% ट्राइटन -100 जोड़ें और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।दो पीबीएस धोने के बाद, प्रत्येक कुएं में ट्यूनल डिटेक्शन वर्किंग सॉल्यूशन जोड़ें और 60 मिनट के लिए अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। एंटी-फ्लोरेसेंस शमन टैबलेट युक्त DAPI जोड़ें और प्रदर्शित छवियों को कैप्चर करें। 48-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में पहले से सुसंस्कृत कोशिकाओं से माध्यम के आधे हिस्से को ताजा माध्यम से बदलें।संक्रमण दक्षता में सुधार के लिए पॉलीब्रेन के बाद एमचेरी जीएफपी-एलसी 3 बी एडेनोवायरस जोड़ें। हर 24 घंटे में माध्यम बदलें। इसके साथ ही एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, संक्रमण की पुष्टि करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति का निरीक्षण करें।एक बार संक्रमित होने के बाद, पांडुलिपि में वर्णित कोशिकाओं को कल्चर और कैप्चर करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ पहले से सुसंस्कृत कोशिकाओं को ठीक करके शुरू करें और 0.1% ट्राइटन -100 जोड़ें। इसके बाद, एक घंटे के लिए पशु-मुक्त ब्लॉक समाधान के साथ कोशिकाओं को अवरुद्ध करें।फिर, उन्हें रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें। अगले दिन, कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें और उन्हें एक घंटे के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें। अंत में, छवियों को कैप्चर करने से पहले एंटी-फ्लोरेसेंस शमन गोलियों वाले डीएपीआई जोड़ें।वर्तमान अध्ययन में, क्रोसेटिन का कोशिकाओं पर एक महत्वपूर्ण प्रोलिफेरेटिव प्रभाव था। जबकि 200 माइक्रोमोलर से ऊपर की एकाग्रता ने एच 9 सी 2 कोशिकाओं के प्रसार को रोक दिया। हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता काफी कम हो गई थी।हालांकि, क्रोसेटिन ने इस परिवर्तन को कुछ हद तक उलट दिया। हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार के बाद बढ़े हुए आरओएस स्तर को कुछ हद तक क्रोसेटिन द्वारा उलट दिया गया था। प्रतिदीप्ति परिणामों ने क्रोसेटिन के साथ आरओएस को कम करने की भी पुष्टि की।इसके अलावा, क्रोसेटिन ने हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार के कारण माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित पतन को बहाल किया। इसी तरह, एपोप्टोसिस को भी क्रोसेटिन द्वारा उलट दिया गया था। इसके अलावा, क्रोसेटिन पूर्व-उपचार ने हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार के कारण प्रेरित एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स के ऑटोफैगी प्रवाह को उलट दिया।क्रोसेटिन पूर्व-उपचार ने हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार द्वारा प्रेरित पार्किन माइटोकॉन्ड्रिया के स्थानांतरण को भी कम कर दिया। इस प्रक्रिया के बाद, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक का उपयोग सीधे एक माइक्रोफेज का निरीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है, जिससे ऑटोफैगोसोम द्वारा घिरे माइटोकॉन्ड्रिया के अधिक सहज दृश्य की अनुमति मिलती है।

Research

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Medicine

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