Name: protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy at JoVE.com

本研究は、北京自然科学基金会(第7202119号)と中国国家自然科学基金会(第82274380号)の支援を受けて行われました。

実験は、中国の北京中医薬大学の生理学研究室で行われました。すべての研究方法は、北京大学の関連ガイドラインおよび規制に従って実施されました。
1. 細胞培養
<ol><li>10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンをダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)基本培地(4.5 g/L D-グルコース、4.g.g/L L-グルタミン、および110 mg/Lピルビン酸ナトリウムを含む; <st...

<ol>
	<li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li><li>Samsky, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiogenic+shock+after+acute+myocardial+infarction:+a+review.">Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review.</a> JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).</li><li>Abbate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+cardiac+remodeling+benefits+in+patients+undergoing+late+percutaneous+coronary+intervention+of+the+infarct-related+artery:+evidence+from+a+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials.">Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).</li><li>Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+heart+failure+in+patients+with+acute+myocardial+infarction+treated+with+primary+percutaneous+coronary+intervention.">Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention.</a> European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).</li><li>Dhruva, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+use+of+an+intravascular+microaxial+left+ventricular+assist+device+vs+intra-aortic+balloon+pump+with+in-hospital+mortality+and+major+bleeding+among+patients+with+acute+myocardial+infarction+complicated+by+cardiogenic+shock.">Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock.</a> JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+associated+with+major+cardiovascular+events+1+year+after+acute+myocardial+infarction.">Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction.</a> JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).</li><li>Jou, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+protects+against+common+deletion+of+mitochondrial+DNA-augmented+mitochondrial+oxidative+stress+and+apoptosis.">Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis.</a> Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).</li><li>La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+supported+by+exogenous+cytochrome+c+oxidation+mimics+the+early+stages+of+apoptosis.">Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).</li><li>De Filippo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+secondary+prevention+medical+therapies+on+outcomes+of+patients+suffering+from+Myocardial+Infarction+with+NonObstructive+Coronary+Artery+disease+(MINOCA):+A+meta-analysis.">Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis.</a> International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitarget+strategies+to+reduce+myocardial+ischemia/reperfusion+injury:+JACC+review+topic+of+the+week.">Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).</li><li>Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+pharmacological+and+non-pharmacological+strategies+of+cardioprotection.">Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+pharmacology+analysis+and+experimental+validation+to+investigate+the+mechanism+of+total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+in+treating+rheumatoid+arthritis.">Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis.</a> Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+has+great+potential+as+candidate+drugs+for+lung+cancer:+A+review.">Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).</li><li>Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+traditional+Chinese+medicine+for+the+prevention+and+treatment+of+atherosclerosis.">Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertensive+heart+disease+and+myocardial+fibrosis:+How+traditional+Chinese+medicine+can+help+addressing+unmet+therapeutical+needs.">Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs.</a> Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).</li><li>Zhang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+intervenes+ventricular+remodeling+following+acute+myocardial+infarction:+evidence+from+40+random+controlled+trials+with+3,659+subjects.">Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).</li><li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+for+cardiovascular+disease:+evidence+and+potential+mechanisms.">Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms.</a> Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).</li><li>Delgado-Montero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stasis+imaging+predicts+cerebral+microembolism+during+acute+myocardial+infarction.">Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).</li><li>Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+trends+in+traditional+Chinese+medicine+for+acute+myocardial+infarction.">Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction.</a> Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).</li><li>Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+on+outcome+of+5284+patients+with+coronary+artery+disease:+the+role+of+integrative+medicine.">Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine.</a> Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crocetin+ester+improves+myocardial+ischemia+via+Rho/ROCK/NF-kappaB+pathway.">Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway.</a> International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting.">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).</li><li>Zeng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+potential+value+and+mechanism+of+Kaji-Ichigoside+F1+on+arsenite-induced+skin+cell+senescence.">Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+JC-1.">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li><li>Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+apoptosis+by+TUNEL+assay.">Detection of apoptosis by TUNEL assay.</a> Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+impairs+the+autophagic+flux+to+induce+p62-dependent+apoptosis+through+the+upregulation+of+CYLD+in+NRCMs.">Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs.</a> Toxicology. 465, 153032 (2022).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+restore+the+MMP/TIMP+balance+in+models+of+osteoarthritis+by+inhibiting+the+activation+of+the+NF-&#954;B+and+PI3K/AKT+pathways.">Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-&#954;B and PI3K/AKT pathways.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).</li><li>Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saffron:+a+potential+candidate+for+a+novel+anticancer+drug+against+hepatocellular+carcinoma.">Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).</li><li>Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+effects+of+saffron:+an+evidence-based+review.">Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review.</a> The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).</li><li>Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+perspective+and+opportunities+in+pharmacologically+important+safflower.">A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower.</a> Metabolites. 10 (6), 253 (2020).</li><li>Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+saffron+supplementation:+current+clinical+findings.">Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+protective+effect+of+salidroside+against+H2O2-induced+injury+in+H9C2+cells.">Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+rhizoma+drynariae+targets+in+the+treatment+of+osteoarthritis+based+on+network+pharmacology+and+experimental+verification.">Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).</li><li>Reers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+monitored+by+JC-1+dye.">Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye.</a> Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).</li><li>Radovits, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibition+improves+endothelial+dysfunction+induced+by+reactive+oxidant+hydrogen+peroxide+in+vitro.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+parkin-mediated+mitophagy+and+mitochondrial+fission+in+adult+mouse+hearts.">Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts.</a> Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).</li><li>Gan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+PINK1.">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li><li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1/Parkin+mitophagy.">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li><li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SQSTM1/p62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN/parkin+in+mitophagy.">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li></ol>

高度な技術による天然薬の複雑な化合物からの効果的な成分の探索は、TCM研究29のホットスポットであり、検証後の将来の医薬品開発のための実験室の証拠を提供することができます。ベニバナは「血行を促進し、うっ血を最小限に抑える」治療における代表的な薬剤であり、心筋梗塞の治療に広く使用されています30,31。サフラ?...

急性心筋梗塞(AMI)は、冠状動脈への重度で持続的な虚血と低酸素によって引き起こされる生命を脅かす心筋壊死です1,2。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は、AMIの第一選択治療戦略の1つであり、通常、心筋細胞を虚血性損傷から保護します3,4。遠位心筋は、AMI後に迅速かつ効果的に治療されない場合、血液と酸素の供給が不足し、虚血性壊死とさらなる心血管合併症を引き起こします5,6。心筋細胞の回復を促進し、PCI手術の機会を逃した後の不可逆的な心筋損傷を最小限に抑えることは、研究のホットスポットとなっています。AMI後、心筋細胞は虚血と低酸素状態にあり、その結果、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が阻害され、NAD+がNADPHに還元され、単電子還元が増加します7。その結果、酸素の不完全な還元反応は過剰な活性酸素種(ROS)を生成し、最終的には心筋細胞8への酸化ストレス損傷につながる。ROSの過剰な蓄積は脂質過酸化を引き起こし、ミトコンドリア膜の構造と機能をさらに破壊します。その結果、ミトコンドリア透過性遷移孔が連続的に開き、ミトコンドリア膜電位が低下し、アポトーシスとネクローシスが誘発されます。
AMIのアンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬(ARB)、βアドレナリン受容体の阻害剤、アルドステロン拮抗薬、およびその他の標準薬は、心筋梗塞後の心機能を高め、不整脈や左心室リモデリングなどの悪性イベントの発生を防ぐのに役立ちます9。しかし、梗塞後の生存率や予後は梗塞の大きさに大きく影響され、心筋細胞のアポトーシスを減少させる上で満足のいく結果は得られていない10,11。このように、心筋梗塞後の心筋細胞回復を促進する薬剤の開発が喫緊の課題となっている。
伝統医学は、長年にわたって現代の製薬研究のインスピレーションの源となっています12,13,14,15。漢方薬(TCM)はAMIの治療に長い歴史があり、近年の一連のランダム化比較試験では、TCMが実際に患者の予後を改善できることが確認されています16,17。TCM理論によれば、AMIはうっ血によって引き起こされるため18,19、血液循環を促進するための薬物は通常、急性期20のAMIの治療に使用されます。その中でもサフランは血液の活性化やうっ滞に強力な効果があると考えられており、AMIの急性期治療によく用いられています。サフランの主成分であるクロセチンは、心筋細胞を保護する上で重要な役割を果たす可能性があります21。
本研究では、AMIの心筋細胞傷害を引き起こす心筋虚血/再灌流を模擬するためにH2O2によってH9c2心筋細胞を誘導し、酸化ストレス誘発性心筋傷害に対するその保護効果を調べるための介入としてクロセチンを使用した。クロセチンが心筋細胞を保護するメカニズムは、マイトファジーを通じてさらに調査されました。さらに重要なことに、この記事では、マイトファジーの研究への技術的アプローチのリファレンスを提供し、実験手順全体を詳細に説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2323363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x protein loading buffer</td>
			<td>Beijing Pulilai Gene Technology</td>
			<td>B1030-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free blocking solution</td>
			<td>CST</td>
			<td>15019s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parkin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PINK1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A11435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TOM20 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A19403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin&#160; antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>KeyGEN Biotech</td>
			<td>KGP902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood cell counting plate</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>WG607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAT assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A007-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A032-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme Q10 (CoQ 10)</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>C6129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocetin</td>
			<td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>RFS-Z01802006012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-containing antifluorescence quenching tablets</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFH-DA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>P10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7.0&#160;</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-Px assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A005-1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 myocardial cells</td>
			<td>Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CS0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>J22202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A020-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A003-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A2114057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perhydrol</td>
			<td>G-clone</td>
			<td>CS7730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gels</td>
			<td>Shanghai Epizyme Biomedical Technology</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE transfer buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2017-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOD assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A001-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLCC9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL apoptosis assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy

この研究は、in vitro実験を通じて、H 2 O2を介したH9c2心筋細胞に対するクロセチンの酸化ストレス保護効果を調査し、そのメカニズムがマイトファジーの影響に関連しているかどうかをさらに調査することを目的としています。この研究はまた、心筋細胞の酸化ストレスに対するベニバナ酸の治療効果を実証し、そのメカニズムがマイトファジーの効果に関連しているかどうかを調べることも目的としています。ここでは、H2O2ベースの酸化ストレスモデルを構築し、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンキナーゼ(CK)、マロンジアルデヒド(MDA)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼ(CAT)、およびグルタチオンペルオキシダーゼ(GSH Px)のレベルを検出することにより、心筋細胞の酸化ストレス傷害の程度を評価しました。活性酸素種(ROS)検出蛍光色素DCFH-DA、JC-1色素、およびTUNEL色素を使用して、ミトコンドリアの損傷とアポトーシスを評価しました。オートファジーフラックスは、Ad-mCherry-GFP-LC3Bアデノウイルスをトランスフェクトすることによって測定した。次に、マイトファジー関連タンパク質をウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光法で検出しました。しかしながら、クロセチン(0.1〜10μM)は、細胞生存率を有意に改善し、H 2 O2によって引き起こされるアポトーシスおよび酸化ストレス損傷を減少させる可能性がある。過剰なオートファジー活性化を有する細胞では、クロセチンはオートファジーの流れとマイトファジー関連タンパク質PINK1およびパーキンの発現を減少させ、パーキンのミトコンドリアへの移行を逆転させる可能性がある。クロセチンは、H 2O2を介した酸化ストレス損傷およびH9c2細胞のアポトーシスを減少させることができ、そのメカニズムはマイトファジーと密接に関連していた。

細胞生存率に対するクロセチンの影響 0.1 μM、0.5 μM、1 μM、5 μM、10 μM、50 μM、および100 μMのクロセチンは細胞に対して有意な増殖効果を示し、200 μMを超える濃度のクロセチンはH9c2細胞の増殖を有意に阻害しました(図1A)。400μM H 2 O2で4時間処理した後、細胞生存率はかなり低下し、クロセチンはこの変化をある程度逆転させることができ...

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Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

本研究では、 クロ セチンが心筋細胞の酸化ストレス損傷を修復するメカニズムを、PINK1/Parkinシグナル伝達経路が重要な役割を果たすマイトファジーに影響を与えることで明らかにしました。

PINK1/パーキン経路を介したマイトファジー を介した クロセチンによる酸化ストレスからのH9c2心筋細胞の保護

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

このプロトコルは、オートファージの研究への技術アプローチのリファレンスを提供し、実験手順全体を詳細に説明しています。この技術の主な利点は、オートファジーフラックスの変化の長さ観察を可能にすることである。実験を開始する前に、有効な感染濃度を決定し、必要な安全対策を講じてください。中和H9C2心筋細胞を179Gで室温で5分間遠心分離することから始めます。上清を捨て、穏やかに吹き付けることによりDMEM完全培地中の細胞を混合する。セルを9つの等しい比率に分割します。対照群にジメチルスルホキシドを加える。次に、残りのグループにさまざまな濃度のクロセチンを追加します。ウェルあたり100マイクロリットルの細胞を96ウェルプレートに播種します。24時間インキュベートしたら、上清を捨てる。その後、細胞をPBSで3回洗浄する。各ウェルに100マイクロリットルのDMEM基礎培地を加え、細胞を摂氏37度で4時間インキュベートします。次に、20マイクロリットルのMTSを追加し、示されているようにさらに2時間インキュベートします。最後に、490ナノメートルの吸光度を測定し、細胞生存率を計算します。ROSを測定するには、DCFH-DAを無血清培地で1:1000の比率で希釈します。H9C2細胞を予め播種した48ウェルプレートから細胞の上清を廃棄します。その後、無血清培地で細胞を2回洗浄する。150マイクロリットルの希釈DCFH-DAを各ウェルに加え、摂氏37度で20分間インキュベートします。次に、無血清培地で細胞を3回洗浄する。最後に、蛍光顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。ミトコンドリア膜電位を分析するには、以前に培養した細胞にJC-1作業溶液を添加し、よく混合します。摂氏37度で20分間インキュベートします。その後、細胞をJC-1染色バッファーで2回洗浄する。各ウェルに完全な培地を添加し、蛍光顕微鏡を使用して写真を撮影します。細胞固定液で細胞を室温で30分間固定する。その後、PBSで一度洗います。各ウェルに0.3%Triton-100を加え、室温で5分間インキュベートします。PBSを2回洗浄した後、TUNEL検出作業溶液を各ウェルに加え、細胞を摂氏37度で暗所で60分間インキュベートします。抗蛍光消光錠剤を含むDAPIを追加し、図示どおりに画像をキャプチャします。48ウェルプレートの各ウェルで、以前に培養した細胞の培地の半分を新しい培地と交換します。mCherry GFP-LC3Bアデノウイルスとそれに続くポリブレンを加えて、感染効率を向上させます。24時間ごとに培地を交換してください。同時に共焦点顕微鏡を用いて蛍光タンパク質の発現を観察し、感染を確認します。感染したら、原稿に記載されているように細胞を培養して捕獲します。以前に培養した細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定することから始め、0.1%Triton-100を加えます。次に、動物を含まないブロック溶液で細胞を1時間ブロックします。次に、一次抗体とともに摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、蛍光二次抗体を細胞に加え、暗所で1時間インキュベートします。最後に、画像をキャプチャする前に、DAPI含有抗蛍光消光錠剤を追加します。本研究では、クロセチンは細胞に対して有意な増殖効果を有した。一方、200マイクロモルを超える濃度はH9C2細胞の増殖を阻害した。細胞生存率は過酸化水素処理後にかなり低下した。しかし、クロセチンはこの変化をある程度逆転させました。過酸化水素処理後のROSレベルの上昇は、クロセチンによってある程度逆転した。蛍光結果はまた、クロセチンによるROSの減少を確認した。また、クロセチン添加は過酸化水素処理によりミトコンドリア膜電位破綻を回復させた。同様に、アポトーシスもクロセチンによって逆転した。さらに、クロセチン前処理は、過酸化水素処理により誘導されたH9C2心筋細胞のオートファジーの流れを逆転させた。クロセチン前処理はまた、過酸化水素処理によって誘発されるパーキンミトコンドリアの転座を減少させた。この手順に続いて、電子顕微鏡を使用してマイクロファージを直接観察することもでき、オートファゴソームに飲み込まれているミトコンドリアをより直感的に見ることができます。

Research

JoVE Journal

Medicine

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Acute Myocardial Infarction in Rats

ラットにおける急性心筋梗塞

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Development of a Unilaterally-lesioned 6-OHDA Mouse Model of Parkinson's Disease

パーキンソン病の単方向、病変6-OHDAモデルマウスの開発

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

心臓ストレステストドブタミンによって誘導され、マウスにおける心臓カテーテル検査によって監視される

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Ultrasonic Assessment of Myocardial Microstructure

心筋微細構造の超音波評価

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

近接リゲーションアッセイを利用したヒト膵臓ベータ細胞における内因性ミトファジー複合体の可視化

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In vitro Assessment of Myocardial Protection following Hypothermia-Preconditioning in a Human Cardiac Myocytes Model

ヒト心臓筋細胞モデルにおける低体温症前処理に対する心筋保護のインビトロ評価

Ischemia/reperfusion-derived myocardial dysfunction is a common clinical scenario in patients after cardiac surgery. In particular, the sensitivity of ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Utilizing Percutaneous Ventricular Assist Devices in Acute Myocardial Infarction Complicated by Cardiogenic Shock

心原性ショックによる急性心筋梗塞における経皮性心室アシスト装置の利用

Cardiogenic shock is defined as persistent hypotension, accompanied by evidence of end organ hypo-perfusion. Percutaneous ventricular assist devices ...

PINK1/パーキン経路を介したマイトファジー を介した クロセチンによる酸化ストレスからのH9c2心筋細胞の保護

PINK1/パーキン経路を介したマイトファジーを介したクロセチンによる酸化ストレスからのH9c2心筋細胞の保護