Name: protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (No. 7202119) e pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82274380).

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Fisiologia da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim, na China. Todos os métodos de estudo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes da Universidade de Pequim.
1. Cultura celular
<ol><li>Adicionar 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina ao meio básico modificado de Eagle (DMEM) da Dulbecco (com 4,5 g/L de D-glicose, 4,g/L de L-glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódio; ...

<ol>
	<li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li><li>Samsky, M. 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M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+heart+failure+in+patients+with+acute+myocardial+infarction+treated+with+primary+percutaneous+coronary+intervention.">Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention.</a> European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).</li><li>Dhruva, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+use+of+an+intravascular+microaxial+left+ventricular+assist+device+vs+intra-aortic+balloon+pump+with+in-hospital+mortality+and+major+bleeding+among+patients+with+acute+myocardial+infarction+complicated+by+cardiogenic+shock.">Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock.</a> JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+associated+with+major+cardiovascular+events+1+year+after+acute+myocardial+infarction.">Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction.</a> JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).</li><li>Jou, M. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+pharmacology+analysis+and+experimental+validation+to+investigate+the+mechanism+of+total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+in+treating+rheumatoid+arthritis.">Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis.</a> Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+has+great+potential+as+candidate+drugs+for+lung+cancer:+A+review.">Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).</li><li>Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+traditional+Chinese+medicine+for+the+prevention+and+treatment+of+atherosclerosis.">Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertensive+heart+disease+and+myocardial+fibrosis:+How+traditional+Chinese+medicine+can+help+addressing+unmet+therapeutical+needs.">Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs.</a> Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).</li><li>Zhang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+intervenes+ventricular+remodeling+following+acute+myocardial+infarction:+evidence+from+40+random+controlled+trials+with+3,659+subjects.">Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).</li><li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+for+cardiovascular+disease:+evidence+and+potential+mechanisms.">Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms.</a> Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).</li><li>Delgado-Montero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stasis+imaging+predicts+cerebral+microembolism+during+acute+myocardial+infarction.">Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).</li><li>Lu, C. 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T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+restore+the+MMP/TIMP+balance+in+models+of+osteoarthritis+by+inhibiting+the+activation+of+the+NF-&#954;B+and+PI3K/AKT+pathways.">Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-&#954;B and PI3K/AKT pathways.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).</li><li>Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+PINK1.">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li><li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1/Parkin+mitophagy.">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li><li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SQSTM1/p62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN/parkin+in+mitophagy.">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li></ol>

A exploração de ingredientes eficazes a partir de compostos complexos de fármacos naturais por meio de tecnologia avançada tem sido um ponto crítico de pesquisa em MTC29, e pode fornecer evidências laboratoriais para o desenvolvimento futuro de fármacos após verificação. O cártamo é uma droga representativa no tratamento de "promover a circulação sanguínea e minimizar a estase sanguínea" e é amplamente utilizado no tratamento do infarto domiocárdio30,31<su...

O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma necrose miocárdica com risco de vida causada por isquemia e hipóxia graves e persistentes nas artérias coronárias 1,2. A intervenção coronária percutânea (ICP) é uma das estratégias terapêuticas de primeira linha para o IAM, e geralmente protege os cardiomiócitos do danoisquêmico3,4. O miocárdio distal carecerá de suprimento sanguíneo e de oxigênio se não for tratado pronta e efetivamente após o IAM, o que leva à necrose isquêmica e a complicações cardiovascularesadicionais 5,6. Promover a recuperação dos cardiomiócitos e minimizar o dano miocárdico irreversível após perder a oportunidade cirúrgica da ICP tem sido um ponto de pesquisa. Após o IAM, os cardiomiócitos encontram-se em estado de isquemia e hipóxia, resultando em inibição da fosforilação oxidativa mitocondrial, redução de NAD+ para NADPH e aumento da redução de um elétron7. Como resultado, a reação de redução incompleta do oxigênio gera um excesso de espécies reativas de oxigênio (EROs) e, finalmente, leva a danos por estresse oxidativo aos cardiomiócitos8. Um acúmulo excessivo de ERO desencadeia a peroxidação lipídica, interrompendo ainda mais a estrutura e a função das membranas mitocondriais. O resultado é uma abertura contínua dos poros de transição da permeabilidade mitocondrial e uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial, induzindo apoptose e necrose.
Os inibidores da enzima conversora da angiotensina (IECA), os bloqueadores dos receptores da angiotensina (BRA), os inibidores dos receptores β-adrenérgicos, os antagonistas da aldosterona e outras drogas padrão no IAM podem ajudar a melhorar a função cardíaca após o infarto do miocárdio e prevenir a ocorrência de eventos malignos, como arritmias e remodelamento ventricularesquerdo9. No entanto, a sobrevida e o prognóstico pós-infarto são muito afetados pelo tamanho do infarto, e resultados satisfatórios não têm sido alcançados para reduzir a apoptose dos cardiomiócitos10,11. Assim, o desenvolvimento de fármacos que promovam a recuperação dos cardiomiócitos após o infarto do miocárdio tornou-se uma questão urgente.
A medicina tradicional tem sido fonte de inspiração para a pesquisa farmacêutica moderna há muitos anos12,13,14,15. A medicina tradicional chinesa (MTC) tem uma longa história no tratamento do IAM, e uma série de estudos clínicos randomizados nos últimos anos confirmou que a MTC pode realmente melhorar o prognóstico dos pacientes16,17. De acordo com a teoria da MTC, o IAM é causado pela estasesanguínea18,19, de modo que drogas para promover a circulação sanguínea são geralmente utilizadas para o tratamento do IAM na faseaguda20. Entre eles, acredita-se que o açafrão tenha um poderoso efeito na ativação e estase sanguínea, e é frequentemente usado no tratamento agudo do IAM. A crocetina, um dos principais componentes do açafrão, pode desempenhar um papel fundamental na proteção dos cardiomiócitos21.
Neste estudo, células miocárdicas H9c2 foram induzidas por H2 O2 para simular isquemia/reperfusão miocárdica, o que causa lesão cardiomiocitária do IAM, e a crocetina foi utilizada como intervenção para investigar seu efeito protetor contra lesão miocárdica induzida por estresse oxidativo. O mecanismo da crocetina protegendo os cardiomiócitos foi mais explorado através da mitofagia. Mais importante, este artigo fornece uma referência para a abordagem técnica para o estudo da mitofagia e descreve todo o procedimento experimental em detalhes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2323363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x protein loading buffer</td>
			<td>Beijing Pulilai Gene Technology</td>
			<td>B1030-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free blocking solution</td>
			<td>CST</td>
			<td>15019s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parkin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PINK1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A11435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TOM20 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A19403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin&#160; antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>KeyGEN Biotech</td>
			<td>KGP902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood cell counting plate</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>WG607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAT assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A007-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A032-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme Q10 (CoQ 10)</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>C6129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocetin</td>
			<td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>RFS-Z01802006012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-containing antifluorescence quenching tablets</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFH-DA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>P10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7.0&#160;</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-Px assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A005-1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 myocardial cells</td>
			<td>Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CS0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>J22202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A020-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A003-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A2114057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perhydrol</td>
			<td>G-clone</td>
			<td>CS7730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gels</td>
			<td>Shanghai Epizyme Biomedical Technology</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE transfer buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2017-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOD assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A001-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLCC9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL apoptosis assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy

O objetivo deste estudo foi explorar o efeito protetor do estresse oxidativo da crocetina sobre células H9c2 H9c2 mediadaspor H2O2 através de experimentos in vitro, e explorar se seu mecanismo está relacionado ao impacto da mitofagia. Este estudo também teve como objetivo demonstrar o efeito terapêutico do ácido cártamo sobre o estresse oxidativo em cardiomiócitos e explorar se seu mecanismo está relacionado ao efeito da mitofagia. Aqui, um modelo de estresse oxidativo baseado em H 2 O2foi construído e avaliou o grau de lesão por estresse oxidativo de cardiomiócitos por meio da detecção dos níveis de lactato desidrogenase (LDH), creatina quinase (CK), malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH Px). Os corantes fluorescentes DCFH-DA, JC-1 e TUNEL que detectam espécies reativas de oxigênio (ROS) foram empregados para avaliar danos mitocondriais e apoptose. O fluxo autofágico foi medido pela transfecção do adenovírus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Proteínas relacionadas à mitofagia foram então detectadas por western blotting e imunofluorescência. No entanto, a crocetina (0,1-10 μM) pode melhorar significativamente a viabilidade celular e reduzir a apoptose e os danos causados pelo estresse oxidativo causados por H 2 O2. Em células com ativação autofágica excessiva, a crocetina também poderia reduzir o fluxo de autofagia e a expressão das proteínas relacionadas à mitofagia PINK1 e Parkin, e reverter a transferência de Parkin para as mitocôndrias. A crocetina foi capaz de reduzir o dano do estresse oxidativo mediado por H 2 O2e a apoptose das células H9c2, e seu mecanismo estava intimamente relacionado à mitofagia.

Efeitos da crocetina na viabilidade celular A crocetina a 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM e 100 μM teve um efeito proliferativo significativo sobre as células, enquanto a crocetina em concentrações acima de 200 μM inibiu significativamente a proliferação de células H9c2 (Figura 1A). Após 4 h de tratamento com 400 μM H 2 O2, a viabilidade celular foi reduzida consideravelmente, e a crocetina conseguiu reverter essa alteração...

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Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Com base em experimentos in vitro , este estudo revelou o mecanismo da crocetina na reparação do dano por estresse oxidativo de cardiomiócitos influenciando a mitofagia, na qual a via de sinalização PINK1/Parkin desempenha um papel importante.

Proteção de Células Miocárdicas H9c2 contra o Estresse Oxidativo por Crocetina via Mitofagia Mediada pela Via PINK1/Parkin

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Este protocolo fornece uma referência para a abordagem técnica para o estudo de autófagos e descreve detalhadamente todos os procedimentos experimentais. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a observação do comprimento da mudança no fluxo autofágico. Antes de iniciar o experimento, determine a concentração de infecção efetiva e tome as medidas de segurança necessárias.Comece centrifugando células miocárdicas H9C2 neutralizadas a 179G por cinco minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e misture as células em meio completo DMEM soprando suavemente. Divida as células em nove proporções iguais.Adicionar dimetilsulfóxido ao grupo controle. Em seguida, adicione concentrações variáveis de crocetina aos grupos restantes. Seme 100 microlitros de células por poço em uma placa de 96 poços.Uma vez incubado por 24 horas, descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as células três vezes com PBS. Adicione 100 microlitros de meio basal DMEM a cada poço e incube as células por quatro horas a 37 graus Celsius.Agora, adicione 20 microlitros de MTS e incube por mais duas horas, como demonstrado. Finalmente, meça a absorbância a 490 nanômetros e calcule a viabilidade celular. Para determinar as EROs, diluir a DCFH-DA na proporção de 1:1000 com o meio sem soro.Descarte o sobrenadante da célula de uma placa de 48 poços, previamente semeada com células H9C2. Em seguida, lave as células duas vezes com um meio sem soro. Adicione 150 microlitros de DCFH-DA diluído a cada poço e incube-o a 37 graus Celsius por 20 minutos.Em seguida, lave as células três vezes com meio sem soro. Finalmente, capturar imagens usando um microscópio de fluorescência. Para analisar o potencial de membrana mitocondrial, adicione a solução de trabalho JC-1 às células previamente cultivadas e misture bem.Incube-os a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, lave as células duas vezes com tampão corante JC-1. Adicione meio completo a cada poço e capture fotografias usando um microscópio de fluorescência.Fixar as células com solução de fixação celular durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave-os com PBS uma vez. Adicionar 0,3% de Triton-100 a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante cinco minutos.Após duas lavagens de PBS, adicione a solução de trabalho de detecção TUNEL a cada poço e incube as células a 37 graus Celsius no escuro por 60 minutos. Adicione DAPI contendo um comprimido de têmpera antifluorescência e capture as imagens conforme demonstrado. Substitua metade do meio das células previamente cultivadas por meio fresco em cada poço de uma placa de 48 poços.Adicione o adenovírus mCherry GFP-LC3B seguido de polibreno para melhorar a eficiência da infecção. Substitua o meio a cada 24 horas. Simultaneamente, usando um microscópio confocal, observar a expressão de proteínas fluorescentes para confirmar a infecção.Uma vez infectadas, cultivar e capturar as células conforme descrito no manuscrito. Comece fixando células previamente cultivadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente e adicione 0,1% de Triton-100. Em seguida, bloqueie as células com uma solução de bloco livre de animais por uma hora.Em seguida, incube-os com um anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione um anticorpo secundário fluorescente às células e incube-as no escuro por uma hora. Finalmente, adicione o DAPI contendo comprimidos de têmpera antifluorescência antes de capturar as imagens.No presente estudo, a crocetina teve um efeito proliferativo significativo sobre as células. Enquanto uma concentração acima de 200 micromolares inibiu a proliferação de células H9C2. A viabilidade celular foi reduzida consideravelmente após o tratamento com peróxido de hidrogênio.No entanto, a crocetina reverteu essa mudança até certo ponto. O aumento do nível de ROS após o tratamento com peróxido de hidrogênio foi revertido pela crocetina até certo ponto. Os resultados de fluorescência também confirmaram a redução das ERO com crocetina.Além disso, a adição de crocetina restaurou os colapsos potenciais de membrana mitocondrial causados pelo tratamento com peróxido de hidrogênio. Da mesma forma, a apoptose também foi revertida pela crocetina. Além disso, o pré-tratamento com crocetina reverteu o fluxo de autofagia dos cardiomiócitos H9C2, induzido pelo tratamento com peróxido de hidrogênio.O pré-tratamento com crocetina também reduziu a translocação de mitocôndrias de Parkin induzida pelo tratamento com peróxido de hidrogênio. Após esse procedimento, a microscopia eletrônica também pode ser usada para observar diretamente um micrófago, permitindo uma visão mais intuitiva das mitocôndrias sendo engolidas por autofagossomos.

Research

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Acute Myocardial Infarction in Rats

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With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

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Desenvolvimento de um Unilateralmente-lesionadas modelo de rato 6-OHDA da Doença de Parkinson

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

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Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Teste de estresse cardíaco induzido por dobutamina e Monitorado por cateterismo cardíaco em ratos

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Avaliação ultrassônica da microestrutura miocárdio

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

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Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

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Utilizando dispositivos de assistência ventricular percutânea em infarto agudo do miocárdio complicado por choque cardiogênico

Cardiogenic shock is defined as persistent hypotension, accompanied by evidence of end organ hypo-perfusion. Percutaneous ventricular assist devices ...