Name: protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy at JoVE.com

Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (No. 7202119) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82274380).

Los experimentos se realizaron en el Laboratorio de Fisiología de la Universidad de Medicina China de Beijing, China. Todos los métodos de estudio se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de la Universidad de Beijing.
1. Cultivo celular
<ol><li>Agregue 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina/estreptomicina al medio básico Eagle medium (DMEM) modificado de Dulbecco (con 4.5 g/L de D-glucosa, 4.g.g/L de L-glutamina y 110 mg/L de piruvato ...

<ol>
	<li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction.">Acute myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li><li>Samsky, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiogenic+shock+after+acute+myocardial+infarction:+a+review.">Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review.</a> JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).</li><li>Abbate, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+cardiac+remodeling+benefits+in+patients+undergoing+late+percutaneous+coronary+intervention+of+the+infarct-related+artery:+evidence+from+a+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials.">Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).</li><li>Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+heart+failure+in+patients+with+acute+myocardial+infarction+treated+with+primary+percutaneous+coronary+intervention.">Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention.</a> European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).</li><li>Dhruva, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+use+of+an+intravascular+microaxial+left+ventricular+assist+device+vs+intra-aortic+balloon+pump+with+in-hospital+mortality+and+major+bleeding+among+patients+with+acute+myocardial+infarction+complicated+by+cardiogenic+shock.">Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock.</a> JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+associated+with+major+cardiovascular+events+1+year+after+acute+myocardial+infarction.">Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction.</a> JAMA Network Open. 1 (4), e181079 (2018).</li><li>Jou, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+protects+against+common+deletion+of+mitochondrial+DNA-augmented+mitochondrial+oxidative+stress+and+apoptosis.">Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis.</a> Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).</li><li>La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+supported+by+exogenous+cytochrome+c+oxidation+mimics+the+early+stages+of+apoptosis.">Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).</li><li>De Filippo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+secondary+prevention+medical+therapies+on+outcomes+of+patients+suffering+from+Myocardial+Infarction+with+NonObstructive+Coronary+Artery+disease+(MINOCA):+A+meta-analysis.">Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis.</a> International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).</li><li>Davidson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multitarget+strategies+to+reduce+myocardial+ischemia/reperfusion+injury:+JACC+review+topic+of+the+week.">Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week.</a> Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).</li><li>Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+pharmacological+and+non-pharmacological+strategies+of+cardioprotection.">Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002 (2019).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+pharmacology+analysis+and+experimental+validation+to+investigate+the+mechanism+of+total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+in+treating+rheumatoid+arthritis.">Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis.</a> Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+has+great+potential+as+candidate+drugs+for+lung+cancer:+A+review.">Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review.</a> Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748 (2023).</li><li>Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+of+traditional+Chinese+medicine+for+the+prevention+and+treatment+of+atherosclerosis.">Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749 (2023).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertensive+heart+disease+and+myocardial+fibrosis:+How+traditional+Chinese+medicine+can+help+addressing+unmet+therapeutical+needs.">Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs.</a> Pharmacological Research. 185, 106515 (2022).</li><li>Zhang, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+intervenes+ventricular+remodeling+following+acute+myocardial+infarction:+evidence+from+40+random+controlled+trials+with+3,659+subjects.">Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 707394 (2021).</li><li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+Chinese+medicine+for+cardiovascular+disease:+evidence+and+potential+mechanisms.">Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms.</a> Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).</li><li>Delgado-Montero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stasis+imaging+predicts+cerebral+microembolism+during+acute+myocardial+infarction.">Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).</li><li>Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+trends+in+traditional+Chinese+medicine+for+acute+myocardial+infarction.">Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction.</a> Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010 (2019).</li><li>Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+on+outcome+of+5284+patients+with+coronary+artery+disease:+the+role+of+integrative+medicine.">Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine.</a> Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crocetin+ester+improves+myocardial+ischemia+via+Rho/ROCK/NF-kappaB+pathway.">Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway.</a> International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting.">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).</li><li>Zeng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+potential+value+and+mechanism+of+Kaji-Ichigoside+F1+on+arsenite-induced+skin+cell+senescence.">Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473 (2022).</li><li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+mitochondria+with+JC-1.">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).</li><li>Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+apoptosis+by+TUNEL+assay.">Detection of apoptosis by TUNEL assay.</a> Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+impairs+the+autophagic+flux+to+induce+p62-dependent+apoptosis+through+the+upregulation+of+CYLD+in+NRCMs.">Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs.</a> Toxicology. 465, 153032 (2022).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting.">Western blotting.</a> Methods. 38 (4), 283-293 (2006).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+flavonoids+of+rhizoma+drynariae+restore+the+MMP/TIMP+balance+in+models+of+osteoarthritis+by+inhibiting+the+activation+of+the+NF-&#954;B+and+PI3K/AKT+pathways.">Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-&#954;B and PI3K/AKT pathways.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837 (2021).</li><li>Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saffron:+a+potential+candidate+for+a+novel+anticancer+drug+against+hepatocellular+carcinoma.">Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).</li><li>Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+effects+of+saffron:+an+evidence-based+review.">Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review.</a> The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).</li><li>Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+perspective+and+opportunities+in+pharmacologically+important+safflower.">A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower.</a> Metabolites. 10 (6), 253 (2020).</li><li>Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+saffron+supplementation:+current+clinical+findings.">Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+protective+effect+of+salidroside+against+H2O2-induced+injury+in+H9C2+cells.">Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271 (2021).</li><li>Chen, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+rhizoma+drynariae+targets+in+the+treatment+of+osteoarthritis+based+on+network+pharmacology+and+experimental+verification.">Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462 (2021).</li><li>Reers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+monitored+by+JC-1+dye.">Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye.</a> Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).</li><li>Radovits, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase+inhibition+improves+endothelial+dysfunction+induced+by+reactive+oxidant+hydrogen+peroxide+in+vitro.">Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro.</a> European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).</li><li>Song, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+parkin-mediated+mitophagy+and+mitochondrial+fission+in+adult+mouse+hearts.">Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts.</a> Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).</li><li>Gan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+PINK1.">Activation mechanism of PINK1.</a> Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).</li><li>Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+molecular+signals+of+PINK1/Parkin+mitophagy.">Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).</li><li>Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SQSTM1/p62+promotes+mitochondrial+ubiquitination+independently+of+PINK1+and+PRKN/parkin+in+mitophagy.">SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy.</a> Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(4th+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).</a> Autophagy. 17 (1), 1 (2021).</li></ol>

La exploración de ingredientes efectivos a partir de compuestos complejos de medicamentos naturales a través de tecnología avanzada ha sido un punto caliente de la investigación de la MTC29, y puede proporcionar evidencia de laboratorio para el desarrollo futuro de medicamentos después de la verificación. El cártamo es un fármaco representativo en el tratamiento de "promover la circulación sanguínea y minimizar la estasis sanguínea" y es ampliamente utilizado en el tratamiento del infar...

El infarto agudo de miocardio (IAM) es una necrosis miocárdica potencialmente mortal causada por isquemia e hipoxia graves y persistentes en las arterias coronarias 1,2. La intervención coronaria percutánea (ICP) es una de las estrategias terapéuticas de primera línea para el IAM, y generalmente protege a los cardiomiocitos del daño isquémico 3,4. El miocardio distal carecerá de suministro de sangre y oxígeno si no se trata con prontitud y eficacia después del IAM, lo que conduce a necrosis isquémica y complicaciones cardiovasculares adicionales 5,6. Promover la recuperación de cardiomiocitos y minimizar el daño miocárdico irreversible después de perder la oportunidad quirúrgica de ICP ha sido un punto caliente de investigación. Después del IAM, los cardiomiocitos se encuentran en un estado de isquemia e hipoxia, lo que resulta en la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial, la reducción de NAD + a NADPH y el aumento de la reducción de un solo electrón7. Como resultado, la reacción de reducción incompleta del oxígeno genera un exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) y, en última instancia, conduce al daño por estrés oxidativo de los cardiomiocitos8. Una acumulación excesiva de ROS desencadena la peroxidación lipídica, alterando aún más la estructura y función de las membranas mitocondriales. El resultado es una apertura continua de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial y una disminución del potencial de la membrana mitocondrial, induciendo apoptosis y necrosis.
Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), los bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA), los inhibidores de los β receptores adrenérgicos, los antagonistas de la aldosterona y otros fármacos estándar en el IAM pueden ayudar a mejorar la función cardíaca después del infarto de miocardio y prevenir la aparición de eventos malignos, como arritmias y remodelación ventricular izquierda9. Sin embargo, la supervivencia y el pronóstico postinfarto se ven muy afectados por el tamaño del infarto, y no se han logrado resultados satisfactorios para reducir la apoptosis cardiomiocitaria10,11. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos para promover la recuperación de los cardiomiocitos después del infarto de miocardio se ha convertido en un tema urgente.
La medicina tradicional ha sido una fuente de inspiración para la investigación farmacéutica moderna durante muchos años12,13,14,15. La medicina tradicional china (MTC) tiene una larga historia en el tratamiento del IAM, y una serie de ensayos controlados aleatorios en los últimos años han confirmado que la MTC puede mejorar el pronóstico de los pacientes16,17. De acuerdo con la teoría de la MTC, el IAM es causado por la estasis sanguínea18,19, por lo que los medicamentos para promover la circulación sanguínea se utilizan generalmente para el tratamiento del IAM en la fase aguda20. Entre ellos, se cree que el azafrán tiene un poderoso efecto sobre la activación y la estasis de la sangre, y se usa a menudo en el tratamiento agudo del IAM. La crocetina, un componente importante del azafrán, puede desempeñar un papel clave en la protección de los cardiomiocitos21.
En este estudio, las células miocárdicas H9c2 fueron inducidas porH2O2para simular isquemia/reperfusión miocárdica, que causa una lesión cardiomiocitaria del IAM, y la crocetina se utilizó como una intervención para investigar su efecto protector contra la lesión miocárdica inducida por el estrés oxidativo. El mecanismo de crocetina que protege a los cardiomiocitos se exploró más a fondo a través de la mitofagia. Más importante aún, este artículo proporciona una referencia para el enfoque técnico para el estudio de la mitofagia y describe todo el procedimiento experimental en detalle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2323363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x protein loading buffer</td>
			<td>Beijing Pulilai Gene Technology</td>
			<td>B1030-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZF-0513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free blocking solution</td>
			<td>CST</td>
			<td>15019s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parkin antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PINK1 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A11435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TOM20 antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>A19403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-actin&#160; antibody</td>
			<td>ABclonal</td>
			<td>AC026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>KeyGEN Biotech</td>
			<td>KGP902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood cell counting plate</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>WG607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAT assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A007-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence detection system</td>
			<td>Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory</td>
			<td>ChemiScope 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A032-1-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme Q10 (CoQ 10)</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>C6129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocetin</td>
			<td>Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>RFS-Z01802006012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI-containing antifluorescence quenching tablets</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZLI-9557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCFH-DA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>S0033S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>8122091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution</td>
			<td>NCM Biotech</td>
			<td>P10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>35-081-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7.0&#160;</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSH-Px assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A005-1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9c2 myocardial cells</td>
			<td>Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CS0062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>ZB-2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit</td>
			<td>LABLEAD</td>
			<td>J22202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A020-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A003-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A2114057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perhydrol</td>
			<td>G-clone</td>
			<td>CS7730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>R0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE gels</td>
			<td>Shanghai Epizyme Biomedical Technology</td>
			<td>PG112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2018-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE transfer buffer powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G2017-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOD assay kits</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A001-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-buffered saline powder</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G0001-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLCC9172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUNEL apoptosis assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protection of h9c2 myocardial cells from oxidative stress by crocetin via pink1/parkin pathway-mediated mitophagy

Este estudio tuvo como objetivo explorar el efecto protector del estrés oxidativo de la crocetina en las células miocárdicas H9c2 mediadas porH2O2 a través de experimentos in vitro, y explorar más a fondo si su mecanismo está relacionado con el impacto de la mitofagia. Este estudio también tuvo como objetivo demostrar el efecto terapéutico del ácido cártamo sobre el estrés oxidativo en cardiomiocitos y explorar si su mecanismo está relacionado con el efecto de la mitofagia. Aquí, se construyó un modelo de estrés oxidativo basado enH2O2y se evaluó el grado de lesión por estrés oxidativo de los cardiomiocitos mediante la detección de los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH), creatina quinasa (CK), malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GSH Px). Se emplearon colorantes fluorescentes detectores de especies reactivas de oxígeno (ROS) DCFH-DA, colorante JC-1 y colorante TUNEL para evaluar el daño mitocondrial y la apoptosis. El flujo autofágico se midió mediante la transfección de adenovirus Ad-mCherry-GFP-LC3B. Las proteínas relacionadas con la mitofagia se detectaron a través de Western blot e inmunofluorescencia. Sin embargo, la crocetina (0,1-10 μM) podría mejorar significativamente la viabilidad celular y reducir la apoptosis y el daño por estrés oxidativo causado porH2O2. En células con activación autofágica excesiva, la crocetina también podría reducir el flujo de autofagia y la expresión de proteínas relacionadas con la mitofagia PINK1 y Parkin, y revertir la transferencia de Parkin a las mitocondrias. La crocetina podría reducir el daño por estrés oxidativo mediado porH2O2y la apoptosis de las célulasH9c2, y su mecanismo estaba estrechamente relacionado con la mitofagia.

Efectos de la crocetina sobre la viabilidad celular La crocetina a 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM y 100 μM tuvo un efecto proliferativo significativo en las células, mientras que la crocetina en concentraciones superiores a 200 μM inhibió significativamente la proliferación de células H9c2 (Figura 1A). Después de 4 h de tratamiento con 400 μMH2O2, la viabilidad celular se redujo considerablemente, y la crocetina pudo revertir ...

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Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Basado en experimentos in vitro , este estudio reveló el mecanismo de la crocetina en la reparación del daño por estrés oxidativo de los cardiomiocitos al influir en la mitofagia, en la que la vía de señalización PINK1 / Parkin juega un papel importante.

Protección de las células miocárdicas H9c2 del estrés oxidativo por crocetina a través de la mitofagia mediada por la vía PINK1 / Parkin

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Este protocolo proporciona una referencia para el enfoque técnico para el estudio de autófagos y describe todos los procedimientos experimentales en detalle. La principal ventaja de esta técnica es que permite la observación de la longitud del cambio en el flujo autofágico. Antes de comenzar el experimento, determine la concentración efectiva de infección y tome las medidas de seguridad necesarias.Comience centrifugando células miocárdicas H9C2 neutralizadas a 179 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y mezcle las células en el medio completo DMEM soplando suavemente. Divide las celdas en nueve proporciones iguales.Agregue dimetilsulfóxido al grupo de control. Luego, agregue concentraciones variables de crocetina a los grupos restantes. Sembrar 100 microlitros de células por pocillo en una placa de 96 pocillos.Una vez incubado durante 24 horas, desechar el sobrenadante. Luego, lave las celdas tres veces con PBS. Agregue 100 microlitros de medio basal DMEM a cada pocillo e incube las células durante cuatro horas a 37 grados centígrados.Ahora, agregue 20 microlitros de MTS e incube durante otras dos horas como se demostró. Finalmente, medir la absorbancia a 490 nanómetros y calcular la viabilidad celular. Para determinar ROS, diluir DCFH-DA en una proporción de 1:1000 con el medio libre de suero.Deseche el sobrenadante de la célula de una placa de 48 pocillos, previamente sembrada con células H9C2. Luego, lave las células dos veces con un medio sin suero. Agregue 150 microlitros de DCFH-DA diluido a cada pocillo e incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos.A continuación, lave las células tres veces con un medio sin suero. Finalmente, capture imágenes usando un microscopio de fluorescencia. Para analizar el potencial de la membrana mitocondrial, agregue la solución de trabajo JC-1 a las células previamente cultivadas y mezcle bien.Incubarlos a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Luego, lave las células dos veces con tampón de tinción JC-1. Agregue un medio completo a cada pocillo y capture fotografías con un microscopio de fluorescencia.Fijar las células con solución de fijación celular durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, lávelos con PBS una vez. Agregue 0.3% Triton-100 a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.Después de dos lavados PBS, agregue la solución de trabajo de detección TUNEL a cada pocillo e incube las células a 37 grados centígrados en la oscuridad durante 60 minutos. Agregue DAPI que contenga una tableta de enfriamiento antifluorescencia y capture las imágenes como se demuestra. Reemplace la mitad del medio de las células previamente cultivadas con medio fresco en cada pocillo de una placa de 48 pocillos.Agregue el adenovirus mCherry GFP-LC3B seguido de porodeno para mejorar la eficiencia de la infección. Reemplace el medio cada 24 horas. Simultáneamente, utilizando un microscopio confocal, observe la expresión de proteínas fluorescentes para confirmar la infección.Una vez infectado, cultive y capture las células como se describe en el manuscrito. Comience fijando las células previamente cultivadas con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente y agregue 0.1% Triton-100. A continuación, bloquee las células con una solución de bloque libre de animales durante una hora.Luego, incubarlos con un anticuerpo primario a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue un anticuerpo secundario fluorescente a las células e incubarlas en la oscuridad durante una hora. Finalmente, agregue el DAPI que contiene tabletas de enfriamiento antifluorescencia antes de capturar las imágenes.En el presente estudio, la crocetina tuvo un efecto proliferativo significativo en las células. Mientras que una concentración por encima de 200 micromolares inhibió la proliferación de células H9C2. La viabilidad celular se redujo considerablemente después del tratamiento con peróxido de hidrógeno.Sin embargo, la crocetina revirtió este cambio hasta cierto punto. El nivel mejorado de ROS después del tratamiento con peróxido de hidrógeno fue revertido por la crocetina hasta cierto punto. Los resultados de fluorescencia también confirmaron una reducción de ROS con crocetina.Además, la crocetina además restauró los colapsos potenciales de la membrana mitocondrial causados por el tratamiento con peróxido de hidrógeno. Del mismo modo, la apoptosis también fue revertida por la crocetina. Además, el pretratamiento con crocetina revirtió el flujo de autofagia de los cardiomiocitos H9C2, inducido debido al tratamiento con peróxido de hidrógeno.El pretratamiento con crocetina también redujo la translocación de las mitocondrias Parkin inducida por el tratamiento con peróxido de hidrógeno. Después de este procedimiento, el microscópico electrónico también se puede usar para observar directamente un microfago, lo que permite una visión más intuitiva de las mitocondrias que están siendo engullidas por autofagosomas.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Acute Myocardial Infarction in Rats

Infarto agudo de miocardio en ratas

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Investigación

Medicina

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Desarrollo de una manera unilateral-lesionado 6-OHDA modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson

The unilaterally lesioned 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned rat model of Parkinson's disease (PD) has proved to be invaluable in advancing our ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Prueba de esfuerzo cardíaco inducida por dobutamina y supervisado por cateterismo cardíaco en ratones

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Evaluación ultrasónica de la microestructura miocárdica

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In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

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Evaluación in vitro de la protección miocárdica después del preaccondicionamiento de hipotermia en un modelo de miocitos cardíacos humanos

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Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Inducción y análisis del estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias de la retina humana transfectadas por transposones de la bella durmiente

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Utilizing Percutaneous Ventricular Assist Devices in Acute Myocardial Infarction Complicated by Cardiogenic Shock

Utilización de dispositivos de asistencia ventricular percutánea en el infarto agudo de miocardio complicado por shock cardiogénico

Cardiogenic shock is defined as persistent hypotension, accompanied by evidence of end organ hypo-perfusion. Percutaneous ventricular assist devices ...