Name: ameliorating osteoarthritis in mice using silver nanoparticles
Uploaded: 2023-06-02T13:10:00
Duration: 5 min 50 s
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Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (Número: 2019A1515010209) y el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Ciudad de Guangzhou, China (Número: 202102010164).

Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Comité de Ética y Bienestar Animal (AEWC) del Centro de Animales de Laboratorio Médico Forevergen de Guangzhou (2018-0186).
1. Establecimiento del modelo de ratón KOA
<ol><li>Mantener ratones BALB/c (18-24 g; 12-14 semanas de edad) en un ambiente con 70% de humedad y a 26 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Para este experimento, los animales se mantuvieron en el Centro de Animales de Laboratorio Médico Forevergen de Guangzhou.</li>
	<li>Utilizar colágeno tipo II para establecer un modelo de ratón KOA como se ha descrito anteriormente21. Realice la inyección intraarticular como se describe a continuación.<ol><li>Aplicar pentobarbital sódico al 2% (40 mg/kg) para la anestesia y buprenorfina (0,05 mg/kg, inyección subcutánea) para la analgesia. A continuación, fije las extremidades del ratón con la cinta, retire el vello con la maquinilla de afeitar y desinfecte con un exfoliante alterno de yodóforo al 0,1% y alcohol tres veces.</li>
		<li>Use guantes estériles y tijeras estériles para exponer secuencialmente la piel, el tejido subcutáneo y el ligamento infrarrotuliano. Mantenga el área de la incisión por debajo de 0,5 cm. NOTA: Se utilizó una manta térmica para mantener la temperatura corporal de los ratones durante la operación.</li>
		<li>Utilice una jeringa de insulina de 1 ml para inyectar 10 U de colagenasa tipo II de 30 mg/kg (0,4 mg/ml) en la cavidad articular (debajo del ligamento infrarrotuliano)22. NOTA: El ángulo entre la aguja y la piel debe ser de aproximadamente 15°; Luego, se debe cambiar la dirección de la aguja y la aguja debe retirarse por completo.</li>
		<li>Después de la inyección, suturar primero el tejido subcutáneo y luego la piel. Esterilizar la zona de sutura con yodóforo al 0,1%. Coloque a los ratones en las jaulas ventiladas individualmente (IVC, por sus siglas en inglés) por separado después de que se despierten de la anestesia.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Síntesis de nanopartículas de plata
NOTA: La preparación de nanopartículas de plata ha sido descrita previamente en detalle19. Todo el proceso de formulación se lleva a cabo sobre hielo. Después de la preparación, la mezcla se almacena a 4 °C; de lo contrario, la mezcla se solidifica fácilmente a temperatura ambiente.
<ol><li>Agregue un total de 400 μL de colágeno tipo I (4 mg/mL) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y colóquelo en hielo.</li>
	<li>Agregue un total de 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) al colágeno anterior, mezcle bien la solución y colóquela en hielo.</li>
	<li>Finalmente, agregue 400 μL de nanopartículas de plata a la solución anterior y luego mezcle lo suficiente. La concentración final de la solución de nanopartículas es de 1 mM. NOTA: El diámetro medio de las nanopartículas de plata oscila entre 5 nm y 15 nm23. Esto fue confirmado por microscopía electrónica.</li>
</ol>3. Tratamiento con nanopartículas de plata de ratones KOA inducidos por colagenasa tipo II
<ol><li>Retire los ratones KOA inducidos por colagenasa tipo II de sus jaulas 1 semana después e inyéctelos con nanopartículas de plata. Inyecte las nanopartículas de plata una vez por semana y recoja las muestras 30 días después.</li>
	<li>Inyectar un total de pentobarbital sódico al 2% (dosis: 2 ml/kg) para anestesia a través de una inyección intraperitoneal, y luego fijar, preparar la piel y esterilizar como se describe en los pasos 1.2.</li>
	<li>Use guantes estériles y tijeras estériles para exponer secuencialmente la piel, el tejido subcutáneo y los ligamentos de la rodilla.</li>
	<li>Use una jeringa de insulina de 1 ml e introduzca la cavidad articular en un ángulo de 15° con la aguja. Inyecte lentamente aproximadamente 20 μL de la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata y retire lentamente la aguja24.</li>
	<li>Suturar el tejido subcutáneo y la piel a su vez, y esterilizar. Coloque a los ratones en jaulas con ventilación individual (IVC, por sus siglas en inglés) por separado después de que se despierten de la anestesia.</li>
	<li>Realice esta inyección de la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata (20 μL) cuatro veces con una frecuencia de una vez por semana. NOTA: Los ratones tratados con la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata deben mantenerse en jaulas individuales. Las peleas de ratones pueden ocurrir cuando se mantienen juntos, y esto afectaría los resultados experimentales. Durante la inyección, habrá una sensación de tensión cuando la aguja llegue a la cavidad articular y se producirá hinchazón en la articulación de la rodilla después de la inyección. La combinación de estos dos métodos permite al investigador asegurarse de que el fármaco se ha inyectado con éxito en la articulación de la rodilla.</li>
</ol>4. Recogida de la articulación de la rodilla y del tejido sinovial
<ol><li>Sacrificar a los ratones con asfixia por dióxido de carbono o cualquier otro protocolo aprobado por el comité de ética animal correspondiente.</li>
	<li>Esterilizar y diseccionar la piel y el tejido subcutáneo secuencialmente, y exponer completamente la articulación de la rodilla.</li>
	<li>Extrae las articulaciones de la rodilla, incluyendo el fémur y la tibia, y retira los tejidos de la musculatura.</li>
	<li>Recoja los tejidos de la articulación de la rodilla, incluidos el fémur, la tibia y los tejidos blandos circundantes (ligamento y cásula), en formol al 10% para su preservación y fijación.</li>
</ol>5. Tinción de hematoxilina-eosina
<ol><li>Después de la fijación durante la noche, incruste las secciones en parafina y use un micrótomo para cortar el tejido incluido en parafina en 0,4 μm de espesor. Utilice las secciones preparadas para una tinción adicional (tinción con hematoxilina-eosina, Safranina O/Fast Green y tinción inmunohistoquímica (IHQ)).</li>
	<li>Desparafinar las secciones dos veces con xileno, remojar en etanol al 100%, 95%, 80% y 70% en secuencia durante 5 minutos cada una, y rehidratar.</li>
	<li>Tiñir las secciones con hematoxilina (0,1 g/100 ml) durante 5 min, y luego colocar directamente en HCl al 1% durante 10 s y eosina (0,5 g/100 ml) durante 1 min.</li>
	<li>Observar los cambios histopatológicos de la membrana sinovial bajo un microscopio.</li>
</ol>6. Safranina O/Verde rápido
<ol><li>Inserte el tejido en parafina y prepare las secciones histológicas como se describe en el paso 5.1.</li>
	<li>Desparafinar las secciones dos veces con xileno y rehidratarlas con una serie de etanol (como etanol al 100%, 95%, 80% y 70% en agua destilada, cada una durante 5 min).</li>
	<li>Tiñe las secciones preparadas con hematoxilina y lávalas con PBS tres veces durante 2 minutos cada una.</li>
	<li>Diferencie las secciones con alcohol de ácido clorhídrico y lávelas con PBS tres veces durante 2 minutos cada una.</li>
	<li>Sumerja las secciones en una solución de tinción Fast Green al 0,02 % durante 5-10 min, seguida de una tinción con Safranina O al 0,1 % durante 1-2 min.</li>
	<li>Diferenciar las secciones con ácido acético al 1%, seguido de lavado con PBS.</li>
	<li>Detectar y analizar la formación de fibrocartílago en las secciones.</li>
</ol>7. Tinción inmunohistoquímica (IHQ)
<ol><li>Incrustar el tejido en parafina y preparar las secciones histológicas como se describe en el paso 5.1.</li>
	<li>Desparafinar las secciones dos veces con xileno y rehidratarlas con una serie de etanol (como etanol al 100%, 95%, 80% y 70% en agua destilada, cada una durante 5 min). Sumerja las secciones en tampón Tris-EDTA (10 mM de base Tris, 1 mM de solución EDTA; pH 9,0) y caliente en un horno microondas a 95 °C durante 10 min para realizar la recuperación del antígeno.</li>
	<li>Exponga las secciones a una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos para eliminar la peroxidasa endógena.</li>
	<li>Tratar las secciones con suero de cabra al 5% para bloquear la unión inespecífica.</li>
	<li>Añadir los anticuerpos primarios diluidos (dilución 1:1.000) frente a CD177 e incubar durante la noche a 4°C. Luego, lave las secciones con PBS tres veces.</li>
	<li>Remojar las secciones con PBS e incubar las secciones con el anticuerpo secundario apropiado (sistema anti-conejo de polímero conjugado con HRP) durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Realice la visualización de la tinción IHQ utilizando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) como cromógeno.</li>
	<li>Visualice las secciones bajo un microscopio y analice las imágenes adquiridas.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Las nanopartículas de plata exhiben efectos antiinflamatorios, antibacterianos, antioxidantes e inmunomoduladores, lo que significa que podrían proteger las células y los tejidos del daño al reducir la producción de especies reactivas de oxígeno26. Algunos investigadores están preocupados por la toxicidad de las nanopartículas de plata27. La toxicidad de las nanopartículas de plata está directamente relacionada con la presencia de iones de plata libres. Debido al tamaño a nanoescala de las nanopartículas de plata, podrían interferir fácilmente con biomoléculas, células y órganos humanos 15,28,29. Varios estudios han reportado que las nanopartículas de plata podrían inducir estrés oxidativo y perjudicar la función mitocondrial en células humanas30. Además, el Ag se puede detectar en órganos humanos, especialmente en el hígado y el bazo, tras el uso de grandes cantidades de nanopartículas de plata. Los investigadores también han informado que las nanopartículas de plata tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica a través del transporte transsináptico y acumularse enel cerebro. No se ha realizado un informe sistemático sobre la biotoxicidad de las nanopartículas de plata, aunque algunos investigadores reconocen la seguridad de las nanopartículas de plata32.
En este estudio, preparamos una mezcla de colágeno con nanopartículas de plata. De hecho, el período de duración de las nanopartículas de plata en los tejidos humanos es breve, pero el período de duración de las nanopartículas de plata puede prolongarse cuando se aplica con una mezcla de colágeno; Esto no solo reduce el trauma, sino también la dosis de los fármacos. Considerando la toxicidad de las nanopartículas de plata, la dosis de nanopartículas de plata aplicada en este estudio fue de 30 mg/kg, en línea con investigaciones previas33.
A continuación se presentan algunas consideraciones vitales de la operación experimental. La colagenasa de tipo II debe almacenarse a -20 °C después de la preparación para evitar la degradación debida a la escisión enzimática. La preparación de la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata debe llevarse a cabo en el hielo de forma continua a temperatura ambiente porque la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata se convierte rápidamente en un gel semisólido y luego no se puede utilizar para la inyección. La solución debe almacenarse a 4 °C después de la preparación. Se debe elegir una jeringa de insulina de 1 ml con una aguja más pequeña para la administración intraarticular, y esto podría prevenir eficazmente la fuga de los medicamentos inyectados. La aguja debe insertarse en un ángulo de 15° para inyectar la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata. Cuando la aguja no es resistente, esto indica que la aguja ha alcanzado la cavidad de la articulación de la rodilla. Después de la inyección, se debe cambiar el ángulo de la inyección y la aguja debe retirarse lentamente para evitar fugas del medicamento inyectado.
En este estudio, las nanopartículas de plata mejoraron eficazmente los síntomas del KOA inducido por la colagenasa tipo II en ratones, demostrando el efecto antiinflamatorio de las nanopartículas de plata. Varios estudios han reportado la presencia de apoptosis en células incubadas in vitro con nanopartículas de plata 34,35,36. La reducción de la hiperplasia sinovial podría haber sido causada por las nanopartículas de plata debido a su participación en el deterioro de la función mitocondrial, o estos resultados podrían haber sido mediados por especies reactivas de oxígeno. Se observó hiperplasia vascular en la membrana sinovial de ratones del grupo modelo KOA. Era posible que las quimiocinas llevaran a los neutrófilos desde los vasos sanguíneos hasta el tejido sinovial durante este proceso y que el estallido de inflamación hiciera que las células consumieran más oxígeno, lo que condujo a la hiperplasia vascular. Por lo tanto, se requieren más experimentos para demostrar la fiabilidad de esta hipótesis. Este estudio aporta beneficios teóricos para la investigación en el tratamiento de la KOA clínica. En estudios futuros, nuestro objetivo es combinar el método del ligamento cruzado anterior (LCA) junto con el método del modelo KOA inducido químicamente para observar el efecto de las nanopartículas de plata. Los resultados experimentales muestran que las nanopartículas de plata pueden disminuir significativamente la infiltración de células inflamatorias en la membrana sinovial en ratones KOA, pero los mecanismos de este efecto aún necesitan más estudios, lo que podría desentrañar la patogénesis de KOA.

La artrosis de rodilla (KOA) es una de las formas más frecuentes de artrosis y supone un complejo proceso patológico en toda la articulación sinovial1. A medida que la población mundial envejece gradualmente, la incidencia de KOA aumenta sustancialmente. El dolor constante en la articulación de la rodilla suele llevar a los pacientes con KOA a buscar tratamiento médico. La etiología del dolor en el KOA puede estar relacionada con la respuesta inflamatoria, la hiperplasia sinovial y la degeneración del cartílago2. Los tejidos de la membrana sinovial están compuestos por dos tipos de células: fibroblastos sinoviales y macrófagos 3,4,5. Los fibroblastos sinoviales producen líquido sinovial. Los macrófagos sinoviales normalmente están inactivos y son activados por la respuesta inflamatoria. La inflamación inicial de la membrana sinovial causa dolor en la articulación de la rodilla6.
La respuesta inmunitaria inflamatoria del tejido sinovial desempeña un papel crucial en la patogénesis de la KOA. Estudios previos han confirmado que existen respuestas inflamatorias en los tejidos de la membrana sinovial en el KOA, conocidas como sinovitis, y el grado de sinovitis del KOA está estrechamente relacionado con la infiltración de células inflamatorias de los tejidos de la membrana sinovial 7,8,9. La sinovitis es una reacción inflamatoria de la membrana sinovial y sus características patológicas son la proliferación de células sinoviales, la formación de nuevos vasos y la infiltración de células inflamatorias 5,10,11.
El objetivo del tratamiento con KOA es aliviar la reacción inflamatoria de la membrana sinovial y retrasar la progresión de la enfermedad. En la actualidad, los principales fármacos clínicos para el tratamiento del KOA son los antiinflamatorios no esteroideos (AINE); sin embargo, presentan efectos secundarios significativos, como la nefrotoxicidad12,13. Las inyecciones intraarticulares de glucocorticoides son otra opción para tratar el KOA; Sin embargo, el glucocorticoide se propaga rápidamente y podría ser metabolizado rápidamente por el derrame articular. Mientras tanto, los pacientes diabéticos con hiperglucemia subyacente deben tener cuidado con las inyecciones continuas de esteroides14. En resumen, no existe una estrategia terapéutica farmacológica disponible para el KOA. Por lo tanto, la exploración de nuevos fármacos para el tratamiento de la KOA es extremadamente urgente.
El tamaño de las nanopartículas de plata es inferior a 100 nm. Debido a sus prominentes efectos antiinflamatorios, antibacterianos y antioxidantes, se han utilizado ampliamente en diversos aspectos de la atención médica y la medicina, como la cicatrización de heridas y las lesiones por quemaduras15,16. También se utilizan en la administración dirigida de fármacos, la obtención de imágenes médicas y el diagnóstico molecular17. La plata (Ag) tiene mayor acción antiinflamatoria y antibacteriana que otras nanopartículas metálicas, como el cobre (Cu), el zinc (Zn) y el hierro (Fe)15. Las nanopartículas de plata, un nuevo tipo de nanomaterial, tienen propiedades antimicrobianas potentes y de amplio espectro. Un estudio previo encontró que en modelos de ratón de lesiones por quemaduras y peritonitis18,19, las nanopartículas de plata podrían inhibir eficazmente la producción de factores inflamatorios y promover la cicatrización de heridas. Un estudio anterior también demostró que las nanopartículas de plata mejoraron la cicatrización de las heridas diabéticas al promover la síntesis de factores de crecimiento y la deposición de colágeno20.
Basándonos en los efectos antiinflamatorios de las nanopartículas de plata, nos propusimos utilizar nanopartículas de plata para tratar el KOA inducido por colágeno tipo II en ratones. Los resultados sugirieron que el número de células de infiltración inflamatoria de la articulación sinovial en ratones se redujo significativamente con este tratamiento. Los resultados también sugirieron que las nanopartículas de plata podrían aliviar significativamente los síntomas de KOA en ratones. Por lo tanto, la aplicación de nanopartículas de plata puede apoyar el desarrollo de nuevas opciones de tratamiento para el KOA clínico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD177 Polyclonal Antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PA5-98759</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302-17-0</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-15912</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0109</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0107</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM500</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver nanoparticle</td>
			<td>Wolcacvi&#160;</td>
			<td>S-10-20</td>
			<td>Store product in the dark at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine O-Fast Green FCF Cartilage Stain Kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>90-15-3</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885-500mg</td>
			<td>None</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ameliorating osteoarthritis in mice using silver nanoparticles

La artrosis de rodilla (KOA) es una de las enfermedades degenerativas de las articulaciones más frecuentes en personas mayores de 45 años. En la actualidad, no existen terapias eficaces para el KOA, y la única estrategia de punto final es la artroplastia total de rodilla (ATR); por lo tanto, el KOA se asocia con cargas económicas y costos sociales. La respuesta inflamatoria inmunitaria está implicada en la aparición y desarrollo de KOA. Previamente establecimos un modelo de ratón de KOA utilizando colágeno tipo II. La hiperplasia del tejido sinovial estaba presente en el modelo, junto con un gran número de células inflamatorias infiltradas. Las nanopartículas de plata tienen efectos antiinflamatorios sustanciales y se han utilizado ampliamente en la terapia tumoral y la administración quirúrgica de fármacos. Por lo tanto, evaluamos los efectos terapéuticos de las nanopartículas de plata en un modelo de KOA inducido por colagenasa II. Los resultados experimentales mostraron que las nanopartículas de plata redujeron significativamente la hiperplasia sinovial y la infiltración de neutrófilos en el tejido sinovial. Por lo tanto, este trabajo demuestra la identificación de una estrategia novedosa para la OA y proporciona una base teórica para prevenir el progreso de la KOA.

El modelo de ratón KOA se indujo utilizando colagenasa tipo II. A partir de 1 semana después de la inducción del modelo, la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata preparada se inyectó en la cavidad articular una vez por semana durante 4 semanas (Figura 1). Los pesos de los ratones de cada grupo se observaron y registraron diariamente. Los resultados mostraron que el peso corporal promedio de los ratones KOA era significativamente menor que el de los ratones en el grupo de control normal. Sin embargo, el peso corporal promedio de los ratones en el grupo colagenasa tipo II + AgNPs fue mayor en comparación con los ratones KOA, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 2). Después de 30 días, los tejidos sinoviales de las articulaciones de la rodilla se recogieron de los ratones y se sometieron a un examen patológico. Se analizaron la hiperplasia, la proliferación vascular, la infiltración inflamatoria de la membrana sinovial y el daño cartilaginoso 5,10,11. Los resultados mostraron que el grosor sinovial de los ratones en el grupo KOA fue significativamente mayor en comparación con el grupo de control normal. En el grupo tratado con la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata, el grosor de la membrana sinovial se redujo en comparación con el grupo KOA (Figura 3). Hubo hiperplasia vascular en la membrana sinovial de los ratones KOA en comparación con el grupo control normal, y la hiperplasia vascular se redujo significativamente en la membrana sinovial de los ratones tratados con la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata (Figura 4). Los resultados de la tinción con Safranina-O mostraron que la matriz del cartílago de los ratones KOA fue destruida, mientras que los ratones tratados con la mezcla de nanopartículas de colágeno de plata mostraron una matriz de cartílago significativamente mejor (Figura 5). Las puntuaciones de las características morfológicas en cada grupo se evaluaron como se describió anteriormente22. Los resultados fueron los siguientes: 0 ± 0 para el grupo salino, 7 ± 0,63 para el grupo colágeno tipo II y 4,2 ± 1,17 para el grupo colagenasa tipo II + AgNPs (Figura 6). CD177 es un importante marcador de neutrófilos25. El CD177 se expresa en el 40%-60% de los neutrófilos en condiciones normales. Sin embargo, la expresión de CD177 en los neutrófilos aumenta significativamente durante la inflamación aguda. Los resultados de la tinción IHQ demostraron que los neutrófilos infiltrados en la región sinovial se redujeron significativamente en el grupo tratado con AgNPs en comparación con el grupo KOA (Figura 7), lo que sugiere que el tratamiento con AgNPs podría mejorar los síntomas de KOA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65111/65111fig01.jpg"> Figura 1: Lugar de la inyección. (A) Imágenes representativas de la inyección de colagenasa tipo II. (B) Imágenes representativas después de la inyección de colagenasa tipo II. (C) Imágenes representativas de la inyección de la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata en el modelo de ratón KOA. (D) Imágenes representativas después de la inyección de la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata en los ratones modelo KOA. La línea punteada roja representa la línea paralela a los ligamentos de la rodilla del ratón. La flecha negra representa el ángulo entre la aguja de la jeringa de insulina y la piel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65111/65111fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65111/65111fig02.jpg"> Figura 2: Cambios en el peso corporal de los ratones de cada grupo. Este panel muestra el peso promedio de los ratones en cada grupo en diferentes puntos de tiempo; el eje x indica el número de días después de la inyección de colagenasa tipo II, y el eje y indica el cambio de pliegue en el peso corporal. Grupo salino (n = 7), grupo colagenasa tipo II (n = 5), grupo colagenasa tipo II + AgNPs (n = 5). *p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65111/65111fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65111/65111fig03.jpg"> Figura 3: Tinción de hematoxilina-eosina (H&E) que representa la hiperplasia sinovial. Los tejidos sinoviales de cada grupo de ratones se recolectaron, fijaron, seccionaron y tiñeron con H&E a los 30 días después de la cirugía. Las flechas dobles representan el grosor sinovial detectado. Barra de escala = 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65111/65111fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65111/65111fig04.jpg"> Figura 4: Imagen representativa de la hiperplasia vascular perisinovial. Las flechas indican los vasos. Barra de escala = 0,05 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65111/65111fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65111/65111fig05.jpg"> Figura 5: Tinción de safranina-O en la articulación de la rodilla en cada grupo de ratones. Barra de escala = 0,2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65111/65111fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65111/65111fig06.jpg"> Figura 6: Puntuaciones de las características morfológicas en cada grupo. Se utilizó el tejido sinovial para medir la puntuación de las características morfológicas de los ratones de cada grupo. Se seleccionaron cinco secciones de tejido en cada grupo para analizar el grado de hiperplasia/agrandamiento de la capa celular de revestimiento sinovial, el grado de infiltración de neutrófilos en el tejido sinovial y el grado de activación del estroma sinovial (Tabla 1). Se utilizó el valor promedio como puntaje final. **p < 0,01 y ***p < 0,001 con una prueba t de Student para cada cohorte en comparación con el grupo KOA no tratado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65111/65111fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65111/65111fig07.jpg"> Figura 7: Tinción inmunohistoquímica de un marcador de neutrófilos en el tejido sinovial en cada grupo de ratones. Se utilizó tinción inmunohistoquímica para detectar la expresión del marcador de neutrófilos CD177 en el tejido sinovial de los ratones de cada grupo. Las flechas indican neutrófilos. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65111/65111fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Puntuación de las características morfológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65111/Table%201.xls" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

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Ameliorating Osteoarthritis in Mice Using Silver Nanoparticles

Aquí se presenta un protocolo para el uso de nanopartículas de plata para mejorar eficazmente los síntomas agudos de la osteoartritis inducida por colagenasa tipo II, incluida la inflamación sinovial, la hiperplasia sinovial, la hiperplasia vascular, etc.

Mejora de la osteoartritis en ratones mediante nanopartículas de plata

Knee osteoarthritis (KOA) is one of the most commonly encountered degenerative diseases of the joints in people over 45 years of age. Currently, there are ...

Este método tiene el potencial de ser utilizado como una nueva estrategia clínica para la osteoartritis de rodilla. Esta técnica es segura, sencilla para las inyecciones locales y el tratamiento es eficaz en la experimentación animal. Las nanopartículas de plata podrían ser aplicables en otras enfermedades inflamatorias y necesitan más investigación.Por lo tanto, es importante tener cuidado al inyectar el tamaño de la rodilla de los ratones, asegurando el procedimiento correcto. Evaluar el llenado manual de la articulación de la rodilla en las rodillas y evitar cualquier fuga de fármacos. Comience colocando un ratón anestesiado en una mesa quirúrgica.Pega con cinta adhesiva las extremidades del ratón y luego afeita el pelaje con una navaja. A continuación, desinfecte la región afeitada tres veces con exfoliantes alternos de yodoformo al 0,1% y alcohol. Con unas tijeras, haga una incisión en la piel, exponiendo secuencialmente el tejido subcutáneo y el ligamento infrarrotuliano.Con una jeringa de insulina de un mililitro, inyecte 10 unidades de colagenasa tipo dos en la cavidad articular. Suturar el tejido subcutáneo, luego suturar la piel. Ahora esterilice el área suturada con yodoformo al 0,1%.Coloque al ratón en jaulas ventiladas individualmente una vez que se despierte de la anestesia. Comience agregando 400 microlitros de colágeno tipo uno a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros colocado en hielo. Ahora, agregue 200 microlitros de PBX, mezcle bien y coloque los tubos sobre hielo.Agregue 400 microlitros de nanopartículas de plata a esta suspensión, lo que hace que la concentración final de nanopartículas sea de un milimol. Mezcla bien la suspensión. Una semana después de la inyección de colagenasa, saque a los ratones KOA de sus jaulas.Antes de inyectar nanopartículas de plata, anestesiar y preparar quirúrgicamente al ratón como se demostró anteriormente. Use tijeras para exponer secuencialmente la piel, el tejido subcutáneo y los ligamentos de la rodilla. Luego, usando la aguja de una jeringa de insulina de un mililitro, ingrese a la cavidad articular en un ángulo de 15 grados e inyecte lentamente 20 microlitros de la mezcla de colágeno de nanopartículas de plata.Durante la inyección, la articulación de la rodilla se hinchará, lo que garantiza el éxito de la inyección de fármacos. Después de suturar y esterilizar el sitio quirúrgico como antes, coloque a los ratones en jaulas ventiladas individualmente una vez que desaparezca el efecto de la anestesia. Esterilizar quirúrgicamente y diseccionar las extremidades del ratón sacrificado.Extraiga las articulaciones de la rodilla, incluidos el fémur y la tibia, y extraiga el tejido muscular. Recoja los tejidos de la articulación de la rodilla, incluidos el fémur y la tibia y el ligamento blando circundante. Encapsular en formalina al 10% para su conservación y fijación.Después de la fijación nocturna de los tejidos, incruste las secciones en parafina. Con un micrótomo, corte los tejidos incrustados en secciones de 0,4 micro de grosor. Someter los tejidos a diferentes técnicas de tinción.El peso corporal promedio de los ratones KOA fue significativamente menor que el de los ratones en el grupo de control. El peso corporal promedio de los ratones en el grupo de colagenasa tipo dos y nanopartículas de plata fue mayor en comparación con los ratones KOA. La tinción HE mostró que el grosor sinovial de los ratones en el grupo KOA fue significativamente mayor en comparación con el grupo control.El grosor sinovial del grupo tratado con nanopartículas se redujo en relación con el grupo KOA. La hiperplasia vascular de la membrana sinovial se observó en el grupo KOA y se encontró que se redujo significativamente en el grupo tratado con nanopartículas. La tinción con safranina-O reveló una matriz de cartílago destruida en ratones KOA, mientras que los ratones tratados con la mezcla de colágeno de nanopartículas mostraron una matriz de cartílago significativamente mejor.Las puntuaciones de las características morfológicas fueron más altas en el grupo tratado con colágeno II en relación con el grupo control. La tinción inmunohistoquímica demostró una reducción de la infiltración de neutrófilos en las regiones sinoviales de los ratones tratados con nanopartículas en comparación con el grupo KOA. Es importante evitar el bloqueo del fármaco durante la inyección de colagenasa tipo II y varias nanopartículas.El efecto terapéutico de varias nanopartículas podría intentarse en modelos animales de lesión del ligamento cruzado anterior.

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