Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

يتم دعم JEK بمنح من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 and 2013/17368-0] و Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 و 309179/2013-0). يتم دعم AAM بمنح من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) و Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911 / 2021-9).

تم الحصول على أجزاء غير مستخدمة من الأوردة الصافن من المرضى الذين يخضعون لجراحة المجازة الأبهرية التاجية في معهد القلب (InCor) ، كلية الطب بجامعة ساو باولو. أعطى جميع الأفراد موافقة مستنيرة للمشاركة في الدراسة ، والتي تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية.
<p class="jove_titl...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

يجب أن يكون جزء الوريد الصافن 2 سم على الأقل لعزل hSVECs بنجاح. يصعب التعامل مع الأجزاء الصغيرة وربط نهايات الوعاء للحفاظ على محلول كولاجيناز لعزل الخلايا. لا تنتج مساحة سطح اللمعية المخفضة خلايا كافية لتوسيع الثقافة. لتقليل مخاطر التلوث بغير ECs ، يجب أن يكون التلاعب بجزء الوريد الصافن لطيفا ج...

يعد خلل الخلايا البطانية (EC) لاعبا رئيسيا في فشل ترقيع الوريد الصافن1،2،3،4. تؤدي الزيادة المستمرة في إجهاد القص والتمدد الدوري إلى تحفيز النمط الظاهري الالتهابي للخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية (hSVECs) 3،4،5،6. لا تزال المسارات الجزيئية الأساسية غير مفهومة تماما ، وقد تستفيد البروتوكولات الموحدة للدراسات في المختبر من الجهود المبذولة للحصول على رؤى جديدة في المنطقة. هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا لعزل وتوصيف وتوسيع hSVECs وكيفية تعريضها لمستويات متغيرة من إجهاد القص والتمدد الدوري ، ومحاكاة ظروف الدورة الدموية الوريدية والشريانية.
يتم عزل hSVECs عن طريق حضانة كولاجيناز ويمكن استخدامها حتى المقطع 8. يتطلب هذا البروتوكول معالجة أقل للسفينة مقارنة بالبروتوكولات الأخرىالمتاحة 7 ، مما يقلل من التلوث بخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية. من ناحية أخرى ، فإنه يتطلب جزءا أكبر من الوعاء لا يقل عن 2 سم للحصول على استخراج EC بكفاءة. في الأدبيات ، تم الإبلاغ عن أنه يمكن أيضا الحصول على ECs من السفن الكبيرة عن طريق الإزالة الميكانيكية 7,8. على الرغم من فعاليته ، إلا أن النهج المادي له عيوب انخفاض إنتاجية EC وتلوث الخلايا الليفية العالي. لزيادة النقاء ، هناك حاجة إلى خطوات إضافية باستخدام الخرز المغناطيسي أو فرز الخلايا ، مما يزيد من تكلفة البروتوكول بسبب الحصول على الخرز والأجسام المضادة 7,8. الطريقة الأنزيمية لها نتائج أسرع وأفضل فيما يتعلق بنقاوة EC وصلاحيتها 7,8.
أكثر الخلايا البطانية استخداما لدراسة الخلل البطاني هي الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs). من المعروف أن النمط الظاهري EC يتغير في أسرة الأوعية الدموية المختلفة ، ومن الضروري تطوير طرق تمثل الوعاء قيد التحقيق 9,10. في هذا الصدد ، يعد إنشاء بروتوكول لعزل hSVEC واستزراعه تحت الضغط الميكانيكي أداة قيمة لفهم مساهمة خلل hSVEC في مرض الكسب غير المشروع في الوريد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

جراحة مجازة الشريان التاجي (CABG) هي إجراء لإعادة توعية عضلة القلب الإقفارية. لا يزال الوريد الصافن يستخدم كقناة تحويل مسار الشريان التاجي على الرغم من انخفاض المباح على المدى الطويل مقارنة بالقنوات الشريانية. تؤدي الزيادة المفاجئة في إجهاد الدورة الدموية المرتبط بالشريان الطعم إلى تلف الأوعية الدموية ، وخاصة البطانة ، التي قد تؤثر على انخفاض سالكية طعم الوريد الصافن (SVG). هنا ، نصف عزل وتوصيف وتوسع الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية (hSVECs). تعرض الخلايا المعزولة عن طريق هضم الكولاجين مورفولوجيا الحصاة النموذجية وتعبر عن علامات الخلايا البطانية CD31 و VE-cadherin. لتقييم تأثير الإجهاد الميكانيكي ، تم استخدام البروتوكولات في هذه الدراسة للتحقيق في المحفزين الفيزيائيين الرئيسيين ، إجهاد القص والتمدد ، على SVGs الشريانية. يتم استزراع hSVECs في غرفة تدفق لوحة متوازية لإنتاج إجهاد القص ، مما يدل على المحاذاة في اتجاه التدفق وزيادة التعبير عن KLF2 و KLF4 و NOS3. يمكن أيضا استزراع hSVECs في غشاء سيليكون يسمح بالتمدد الخلوي المتحكم فيه الذي يحاكي التمدد الوريدي (المنخفض) والشرياني (العالي). يتم تعديل نمط F-actin للخلايا البطانية وإفراز أكسيد النيتريك (NO) وفقا لذلك من خلال الامتداد الشرياني. باختصار ، نقدم طريقة مفصلة لعزل hSVECs لدراسة تأثير الإجهاد الميكانيكي الديناميكي للدورة على النمط الظاهري البطاني.

عادة ، يمكن ملاحظة ECs الملتصقة بعد 3-4 أيام من الاستخراج. تشكل hSVECs في البداية مجموعات من الخلايا وتعرض مورفولوجيا "مرصوفة بالحصى" نموذجية (الشكل 1 ب). يعبرون عن علامات EC CD31 (الشكل 1C ، D) و VE-cadherin (الشكل 1D). يمكن نشر hSVECs بسهولة على طبق زراعة ?...

Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

وصفنا بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية (hSVECs). كما نقدم طرقا مفصلة لإنتاج إجهاد القص والتمدد لدراسة الإجهاد الميكانيكي في hSVECs.

عزل الخلايا البطانية الوريدية الصافن البشرية والتعرض لمستويات مضبوطة من إجهاد القص والتمدد

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

يتعرض الوريد الصافن فجأة لأمراض الشرايين بعد جراحة مجازة الشريان التاجي. قد يساعد فهم استجابة التكيف مع الإجهاد الميكانيكي في تصميم أدوات علاجية لمنع فشل ترقيع الوريد. بروتوكول عزل الخلايا البطانية هذا بسيط للغاية ولا يتطلب سوى الحضانة باستخدام كولاجيناز.مع الحد الأدنى من التلاعب بالأوعية الدموية ، يؤدي ذلك إلى تقليل التلوث بخلايا العضلات الملساء والخلايا الليفية. يعد بروتوكول عزل SVECs البشرية واستزراعتها تحت إجهاد القص والتمدد الدوري ضروريا لفهم مساهمة القوى الميكانيكية في خلل الخلايا البطانية المرتبط بفشل ترقيع الوريد الصافن. إن زراعة الخلايا البطانية السابقة تتطلب الكثير من حيث مكملات وسائط الخلية.من الضروري إضافة عوامل النمو لعزل الثقافة بنجاح ، SVECs البشرية. لعزل الخلايا البطانية للوريد الصافن البشري الأولي أو الخلايا الجذعية الصافنة البشرية ، اجمع ما لا يقل عن مقطع وريد صافن بطول 2 إلى 3 سنتيمترات. العمل تحت غطاء تدفق رقائقي معقم ، انقل جزء الوريد إلى طبق بتري مملوء ب PBS المسخن مسبقا.لإزالة كل الدم من داخل التجويف ، أدخل طرف ماصة متصلا بماصة ومليئة ب PBS في أحد طرفي الوريد واغسله برفق. اغسله حتى يصبح تدفق الغسيل واضحا تماما. ثم أغلق أحد طرفي الوريد بخياطة قطنية معقمة.املأ الوعاء بعناية بملليغرام واحد لكل محلول كولاجيناز من النوع 2 ملليلتر وأغلق الطرف الآخر من الوعاء بخياطة قطنية. احتضان الوعاء بمحلول كولاجيناز في جو مرطب من 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم اقطع أحد طرفي الوعاء فوق أنبوب سعة 15 ملليلتر لجمع محلول كولاجيناز قبل قطع الطرف الآخر.اغسل السطح اللمعي بواحد إلى ملليلتر من PBS لجمع كل الخلايا البطانية المنفصلة داخل الأنبوب باستخدام كولاجيناز. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من وسط الخلية البطانية الكامل الذي يحتوي على محلول هيبارين إضافي.طبق الخلايا في طبق زراعة الخلايا 60 ملم مغلفة مسبقا بوزن 3٪ لكل حجم جيلاتين. احتضان الخلايا في جو مرطب لمدة أربعة أيام دون تغيير الوسط. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسط كل يوم دون إضافة مكملات الهيبارين.افحص اللوحة تحت المجهر للتأكد من إزالة خلايا الدم الحمراء. بعد يوم إلى أربعة أيام بعد الاستخراج ، اعتمادا على حجم وقطر جزء الوريد ، تصور SVECs البشرية عن طريق الفحص المجهري لتباين الطور لتقييم درجة التقاء ومورفولوجيا الحصى. استمر في تغيير الوسائط كل يومين حتى تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ إلى 80٪.قم بتغطية شريحة غرفة التدفق بوزن 0.1٪ لكل حجم جيلاتين واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية. لتحقيق التوازن بين الوحدة السائلة ومجموعة التروية المعقمة التي تحتوي على خزانات 10 ملم ، احتضان تلك الخزانات طوال الليل في جو مرطب. بالنسبة لتجربة إجهاد القص ، تم تعليق 200،000 خلية بطانية في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع في شريحة غرفة التدفق المطلية بالجيلاتين.لربط الخلايا بسطح الثقافة ، احتضان الخلايا لمدة أربع ساعات. ضع مجموعة التروية على الوحدة السائلة. املأ الخزانات ومجموعة التروية بحوالي 12 ملليلترا من وسط الخلية البطانية الكاملة التي تم تسخينها مسبقا.قم بإزالة فقاعات الهواء من مجموعة التروية لموازنة مستوى كلا الخزانين عند خمسة ملليلتر. ضع الوحدة السائلة على مجموعة التروية المركبة بدون شريحة الغرفة في الحاضنة وقم بتوصيل الكابل الكهربائي بالمضخة التي ينظمها الكمبيوتر. من خلال تشغيل البروتوكول المحدد مسبقا في برنامج التحكم في المضخة ، قم بإزالة جميع فقاعات الهواء من الخزانات ومجموعة التروية.خذ الوحدة السائلة مع ضبط التروية المركبة على غطاء التدفق الصفحي وأرفق الشرائح التي تحتوي على طبقة أحادية لخلية التقاء. بعد وضع الوحدة بأكملها مع الشرائح في الحاضنة ، قم بتوصيل الكابل الكهربائي بالمضخة. في برنامج التحكم في المضخة ، اضبط إعداد الوحدة السائلة عن طريق تحديد نوع الشريحة وضبط لزوجة الوسيط.في معلمات التدفق، أدخل قيمة إجهاد القص واضبط مدة الدورة ونوع التدفق. ثم انقر فوق زر التشغيل لبدء التجربة. تذكر الحفاظ على الشريحة مع الخلايا المعالجة بنفس الوسائط دون التعرض للتدفق كعناصر تحكم ثابتة.ضع مادة تشحيم قائمة على السيليكون على قمم وجوانب محطة التحميل المتوازنة المحورية 25 ملم 6 آبار. البذور 400،000 خلية معلقة في ثلاثة ملليلتر لكل بئر من ألواح الاستزراع ذات القاع المرن ذات 6 بئر المغلفة بالكولاجين. احتضان الخلايا في الهواء المرطب حتى تصل إلى التقاء 100٪.قبل البدء في بروتوكول التمدد ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا وأضف ثلاثة ملليلتر من وسط الثقافة الطازج لكل بئر. أدخل لوحة القاعدة مع جميع محطات التحميل المشحمة في الحاضنة وقم بتوصيل الأنبوب بشكل مناسب بمعدات التحكم في نظام المفاعل الحيوي لتمديد خلية التوتر. قم بتوصيل كل لوحة ثقافة بحشية حمراء واحدة يوفرها نظام المفاعل الحيوي.ثم ضعها في لوحة القاعدة في الحاضنة. ضع جميع لوحات الاستزراع الأربعة في لوحة القاعدة لتحقيق الفراغ المناسب وحمل التمدد. قم بتشغيل معدات التحكم ونظام الكمبيوتر.افتح برنامج التحكم FlexCell وقم بتكوين النظام المطلوب بما في ذلك النسبة المئوية للاستطالة وشكل الموجة والتردد والوقت. احفظ النظام. قم بتشغيل نظام الفراغ ، ثم حدد النظام وانقر فوق ابدأ على شاشة الكمبيوتر لتشغيل التمدد.تأكد من أن غشاء السيليكون يتحرك ويمتد الخلايا. يمكن ملاحظة الخلايا البطانية الملتصقة بعد 4 إلى 10 أيام من الاستخراج. وهي تشكل في البداية مجموعات خلايا تعرض مورفولوجيا نموذجية مرصوفة بالحصى.أعربوا عن علامات EC CD31 و VE-cadherin. يتم استزراع hSVECs عند استزراعها تحت ضغط القص في اتجاه التدفق. إن إجهاد القص البالغ 20 داين لكل سنتيمتر مربع لمدة 72 ساعة يحفز التعبير عن الجينات الميكانيكية النموذجية الحساسة ، KLF2 و KLF4 و NOS3 ، مما يشير إلى فعالية حافز القص.تعتمد نتيجة التمدد الدوري على الشدة المطبقة على SVECs البشرية. أظهرت الخلايا تحت التمدد المنخفض نمط F-actin القشري مشابه للخلايا الثابتة. بدون تغيير في إطلاق أكسيد النيتريك لمدة تصل إلى 72 ساعة ، أعادت مستويات تمدد الشرايين لدينا تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين بعد 24 ساعة وانخفضت عدم الإطلاق بعد 72 ساعة.إلى جانب دراسات الإجهاد الميكانيكي ، يمكن للباحثين استخدام الخلايا المعزولة لأداء طرق مختلفة لتوسيع المعرفة بوظيفة الخلية البطانية والخلل الوظيفي. باتباع البروتوكول الموضح ، من الممكن دراسة أي نوع آخر من الخلايا البطانية تحت إجهاد القص والتمدد.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

عزل الخلايا الظهارية ماوس الجهاز التنفسي والتعرض لدخان السجائر في واجهة تجريبية الهواء السائل

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

زرع الشريان السباتي الكفة لتحريك القص من التوتر في الفئران المستحثة تصلب الشرايين

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

الأبعاد 3-صب الراتنج والتصوير من الوريد البابي داخل الكبد أو ماوس نظام القناة الصفراوية

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

تسيطر الاصابات تهتك عنق في الفئران

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

العزلة والثقافة، والتصوير من الجنين البنكرياس الإنسان الكتل الخليوي

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

والتعديل<em&gt; في المختبر</em&gt; الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

إجراءات الصافن عروق الإنسان<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الإرواء والتعزيز الخارجي

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

العزلة وثقافة توسيع ورم محددة الخلايا البطانية

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...