Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

JEK støttes af tilskud fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 og 2013/17368-0] og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 og 309179/2013-0). AAM støttes af tilskud fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Ubrugte segmenter af saphenøse vener blev opnået fra patienter, der gennemgik aortokoronar bypassoperation ved Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Alle personer gav informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen, som blev gennemgået og godkendt af den lokale etiske komité.
1. Isolering, kultur og karakterisering af primære humane saphenøse veneendotelceller (hSVEC'er)
<ol><li>Præparation<ol><li>Autoklave et par lige eller buede tang ...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

Det saphenøse venesegment skal have været mindst 2 cm for at kunne isolere hSVEC'er med succes. Små segmenter er vanskelige at håndtere og binde enderne af beholderen for at opretholde kollagenaseopløsningen for at isolere cellerne. Det reducerede luminale overfladeareal giver ikke tilstrækkelige celler til at udvide kulturen. For at minimere risikoen for kontaminering med ikke-EC'er skal manipulationen af saphenøse venesegmentet være meget skånsom under hele proceduren. Det er vigtigt at være forsigtig, når p...

Endotelcelle (EC) dysfunktion er en nøglespiller i saphenøs venetransplantatsvigt 1,2,3,4. Den vedvarende stigning i forskydningsstress og cyklisk strækning inducerer den proinflammatoriske fænotype af humane saphenøse veneendotelceller (hSVEC'er)3,4,5,6. De underliggende molekylære veje er stadig ikke fuldt ud forstået, og standardiserede protokoller til in vitro-undersøgelser kan udnytte indsatsen for ny indsigt på området. Her beskriver vi en simpel protokol til at isolere, karakterisere og udvide hSVEC'er, og hvordan man udsætter dem for variable niveauer af forskydningsstress og cyklisk strækning, der efterligner de venøse og arterielle hæmodynamiske tilstande.
hSVEC'er isoleres ved kollagenaseinkubation og kan anvendes indtil passage 8. Denne protokol kræver mindre manipulation af beholderen sammenlignet med de andre tilgængelige protokoller7, hvilket reducerer forurening med glatte muskelceller og fibroblaster. På den anden side kræver det et større fartøjssegment på mindst 2 cm for at have effektiv EC-ekstraktion. I litteraturen er det blevet rapporteret, at EC'er fra store fartøjer også kan opnås ved mekanisk fjernelse 7,8. Selvom den fysiske tilgang er effektiv, har den ulemperne ved lavt EF-udbytte og højere fibroblastforurening. For at øge renheden er der behov for ekstra trin ved hjælp af magnetiske perler eller cellesortering, hvilket øger omkostningerne ved protokollen på grund af erhvervelsen af perler og antistoffer 7,8. Den enzymatiske metode giver hurtigere og bedre resultater med hensyn til EF-renhed og levedygtighed 7,8.
De hyppigst anvendte EC'er til at studere endoteldysfunktion er humane navlestrengendotelceller (HUVEC'er). Det er kendt, at EF-fænotypen ændres i forskellige vaskulære senge, og det er vigtigt at udvikle metoder, der repræsenterer beholderen under undersøgelse 9,10. I denne henseende er etableringen af en protokol til isolering af en hSVEC og dyrkning af den under mekanisk belastning et værdifuldt redskab til at forstå bidraget fra hSVEC-dysfunktion i venetransplantatsygdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

Koronararterie bypass graft (CABG) kirurgi er en procedure til revaskularisering iskæmisk myokardium. Saphenøs vene forbliver brugt som en CABG-kanal på trods af den reducerede langsigtede patency sammenlignet med arterielle ledninger. Den pludselige stigning i hæmodynamisk stress forbundet med transplantatarterielisering resulterer i vaskulær skade, især endotelet, der kan påvirke den lave patency af saphenøs venetransplantat (SVG). Her beskriver vi isolering, karakterisering og udvidelse af humane saphenøse veneendotelceller (hSVEC'er). Celler isoleret ved kollagenasefordøjelse viser den typiske brostenmorfologi og udtrykker endotelcellemarkører CD31 og VE-cadherin. For at vurdere den mekaniske stressindflydelse blev protokoller anvendt i denne undersøgelse til at undersøge de to vigtigste fysiske stimuli, forskydningsspænding og strækning, på arterialiserede SVG'er. hSVEC'er dyrkes i et parallelt pladeflowkammer for at producere forskydningsspænding, der viser justering i strømningsretningen og øget ekspression af KLF2, KLF4 og NOS3. hSVEC'er kan også dyrkes i en siliciummembran, der tillader kontrolleret cellulær strækning, der efterligner venøs (lav) og arteriel (høj) strækning. Endotelcellernes F-actinmønster og nitrogenoxidsekretion (NO) moduleres i overensstemmelse hermed af arteriestrækningen. Sammenfattende præsenterer vi en detaljeret metode til at isolere hSVEC'er for at studere indflydelsen af hæmodynamisk mekanisk stress på en endotelfænotype.

Typisk kan klæbede EC'er observeres 3-4 dage efter ekstraktion. hSVEC'er danner oprindeligt klynger af celler og viser en typisk "brostensmorfologi" (figur 1B). De udtrykker EC-markørerne CD31 (figur 1C, D) og VE-cadherin (figur 1D). hSVEC'er kan let formeres på en ikke-coatet behandlet cellekulturskål, og de bevarer endotelfænotypen i kultur op til otte passager.
hSVEC'er justeres i...

Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Vi beskriver en protokol til isolering og dyrkning af humane saphenøse veneendotelceller (hSVEC'er). Vi leverer også detaljerede metoder til at producere forskydningsspænding og stræk for at studere mekanisk belastning i hSVEC'er.

Human saphenøs veneendotelcelleisolering og eksponering for kontrollerede niveauer af forskydningsstress og strækning

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Den saphenøse vene udsættes pludselig for arterielle tilstande efter koronararterie bypass operation. Forståelse af dets tilpasningsrespons på mekanisk stress kan hjælpe med at designe terapeutiske værktøjer til at forhindre venetransplantatfejl. Denne endotelcelleisolationsprotokol er meget enkel og kræver kun inkubation med kollaganase.Med minimal karmanipulation resulterer dette i reduceret forurening med glatte muskelceller og fibroblaster. Protokollen til isolering af humane SVEC'er og dyrkning af dem under forskydningsspænding og cyklisk strækning er afgørende for at forstå bidraget fra mekaniske kræfter i endotelcelledysfunktion forbundet med saphenøs venetransplantatsvigt. Tidligere endotelcellekultur er meget krævende med hensyn til cellemedietilskud.Det er obligatorisk at tilføje vækstfaktorer for med succes at isolere en kultur, de humane SVEC'er. Til isolering af primære humane saphenøse veneendotelceller eller humane SVEC'er skal du indsamle mindst et to til tre centimeter langt saphenøst venesegment. Arbejd under en steril laminar strømningshætte, overfør venesegmentet til en petriskål fyldt med forvarmet PBS.For at fjerne alt blodet inde fra lumen skal du indsætte en pipettespids, der er fastgjort til en pipette og fyldt med PBS, i den ene ende af venen og skylle den forsigtigt. Skyl det, indtil vaskestrømmen bliver helt klar. Luk derefter den ene ende af venen med en steril bomuldsutur.Fyld forsigtigt beholderen med et milligram pr. milliliter collagenase type 2-opløsning og luk den anden ende af beholderen med en bomuldsutur. Inkuber beholderen med kollagenaseopløsning i en befugtet atmosfære af 5% kuldioxid ved 37 grader celsius i en time. Skær derefter den ene ende af beholderen over et 15 ml rør for at opsamle kollagenaseopløsningen, før du skærer den anden ende.Skyl luminaloverfladen med en til to ml PBS for at samle alle de løsrevne endotelceller inde i røret med collagenase. Centrifuger røret ved 400G ved stuetemperatur i fem minutter. Efter fjernelse af supernatanten opslæmmes cellepelletten igen i tre til fire ml komplet endotelcellemedium indeholdende en yderligere heparinopløsning.Plade cellerne i en 60 millimeter cellekulturskål, der er forbelagt med gelatine på 3% vægt pr. Volumen. Inkuber cellerne i en befugtet atmosfære i fire dage uden at ændre mediet. Derefter ændres mediet hver anden dag uden at tilføje heparintilskuddet.Undersøg pladen under mikroskopet for at sikre, at de røde blodlegemer blev fjernet. Efter en til fire dage efter ekstraktion, afhængigt af venesegmentets størrelse og diameter, visualiseres de humane SVEC'er ved fasekontrastmikroskopi for at evaluere graden af sammenløb og deres brostensmorfologi. Fortsæt med at skifte medie hver anden dag, indtil cellerne når 70% til 80% sammenløb.Overtræk strømningskammerets objektglas med 0,1% vægt pr. volumen gelatine og inkuber i mindst 30 minutter ved 37 grader Celsius. For at afbalancere den flydende enhed og det sterile perfusionssæt med 10 millimeter reservoirer inkuberes dem natten over i en befugtet atmosfære. Til forskydningsspændingseksperimentet frø 200.000 endotelceller suspenderet i 100 mikroliter kulturmedium ind i det gelatinebelagte strømningskammerglas.For at fastgøre cellerne til kulturoverfladen inkuberes cellerne i fire timer. Placer perfusionssættet på fluidenheden. Udfyld reservoirerne og perfusionssættet med ca. 12 ml forvarmet komplet endotelcellemedium.Fjern luftbobler fra perfusionssættet for at afbalancere niveauet af begge reservoirer ved fem ml. Placer fluidenheden på det monterede perfusionssæt, uden at kammeret glider i inkubatoren, og tilslut det elektriske kabel til den computerregulerede pumpe. Ved at køre den foruddefinerede protokol i pumpestyringssoftwaren skal du fjerne alle luftbobler fra reservoirerne og perfusionssættet.Tag den fluidiske enhed med det monterede perfusionssæt til laminær strømningshætte, og fastgør diasene med et sammenløbscellemonolag. Når du har placeret hele enheden med diasene i inkubatoren, skal du tilslutte det elektriske kabel til pumpen. I pumpestyringssoftwaren skal du justere opsætningen af fluidenheden ved at vælge glidetype og indstille mediets viskositet.Angiv forskydningsspændingsværdien i flowparametre, og angiv cyklusvarighed og flowtype. Klik derefter på afspilningsknappen for at starte eksperimentet. Husk at vedligeholde diaset med celler, der er behandlet med det samme medie uden eksponering for flow som statiske kontroller.Påfør silikonebaseret smøremiddel på toppen og siderne af den 25 millimeter 6-brønds ækvibiaxiale lastestation. Frø 400.000 celler suspenderet i tre milliliter til hver brønd af de 6-brønds fleksible kulturplader belagt med kollagen en. Inkuber cellerne i befugtet luft, indtil de når 100% sammenløb.Før du starter strækprotokollen, skal du vaske cellerne en gang med forvarmet PBS og tilføje tre ml frisk kulturmedium pr. Brønd. Indsæt bundpladen med alle smurte lastestationer i inkubatoren, og tilslut slangen korrekt med styreudstyret i spændingscellestrækningsbioreaktorsystemet. Fastgør hver kulturplade til en rød pakning, der leveres af bioreaktorsystemet.Sæt dem derefter i bundpladen i inkubatoren. Placer alle fire kulturplader i bundpladen for at opnå korrekt vakuum og strækningsbelastning. Tænd controllerudstyret og computersystemet.Åbn FlexCell-styringssoftwaren, og konfigurer det ønskede regime, herunder procentdelen af forlængelse, bølgeform, frekvens og tid. Gem behandlingen. Tænd vakuumsystemet, vælg derefter regimet, og klik på start på computerskærmen for at køre strækningen.Kontroller, at silikonemembranen bevæger sig og strækker cellerne. De klæbende endotelceller kunne observeres 4 til 10 dage efter ekstraktionen. De danner oprindeligt celleklynger, der viser en typisk brostensmorfologi.De udtrykte EF-markørerne CD31 og VE-cadherin. HSVEC'erne, når de dyrkes under forskydningsspænding, justeres i strømningsretningen. Forskydningsspændingen på 20 dyner pr. kvadratcentimeter i 72 timer inducerer ekspressionen af typiske mekanofølsomme gener, KLF2, KLF4 og NOS3, hvilket indikerer effektiviteten af forskydningsstimulus.Det cykliske strækresultat afhang af intensiteten anvendt på de humane SVEC'er. Celler under lav strækning viste et kortikalt F-actinmønster svarende til statiske celler. Uden ændring i nitrogenoxidfrigivelsen i op til 72 timer ombyggede vores arterielle strækniveauer actincytoskelettet efter 24 timer og reducerede NO-frigivelse efter 72 timer.Udover mekaniske stressstudier kan forskerne bruge de isolerede celler til at udføre forskellige metoder til at udvide viden om endotelcellers funktion og dysfunktion. Efter den demonstrerede protokol er det muligt at studere enhver anden type endotelceller under forskydningsspænding og strækning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantation af en carotis Cuff til udløsning af shear-stress Induced Åreforkalkning i Mus

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-dimensionelt Resin Støbning og Imaging of Mouse Portal Vein eller Intrahepatisk galdegang System

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Kontrolleret Livmoderhalskræft laceration Injury i mus

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolation, Kultur og Imaging for Human Føtal pankreascelle Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

En modificeret<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Assay at bestemme rolle Hormoner, cytokiner og / eller vækstfaktorer ved mediering Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Menneskerettigheder saphenous Veins<em&gt; Ex vivo</em&gt; Perfusion og udvendig forstærkning

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering af human lymfeendotelceller af Multi-parameter Fluorescens-aktiveret cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolering og dyrkning Udvidelse af Tumorspecifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering og dyrkning af Primære endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...