Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

JEK wordt ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 en 2013/17368-0] en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 en 309179/2013-0). AAM wordt ondersteund door subsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Ongebruikte segmenten van saphena-aderen werden verkregen van patiënten die een aortocoronaire bypass-operatie ondergingen aan het Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Alle personen gaven geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan de studie, die werd beoordeeld en goedgekeurd door de lokale ethische commissie.
1. Isolatie, kweek en karakterisering van primaire menselijke veneuze ader endotheelcellen (hSVECs)
<ol><li>Voorbereiding<ol><li>Aut...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

Het venadelensegment van de saphena moet minstens 2 cm zijn om hSVECs met succes te isoleren. Kleine segmenten zijn moeilijk te hanteren en binden de uiteinden van het vat om de collagenase-oplossing te behouden om de cellen te isoleren. Het verminderde luminale oppervlak levert niet voldoende cellen op om de cultuur uit te breiden. Om het risico op besmetting met niet-EC's te minimaliseren, moet de manipulatie van het venadelensegment van het saphenous tijdens de hele procedure zeer voorzichtig zijn. Het is belangrijk o...

Endotheliale cel (EC) disfunctie is een belangrijke speler in saphenous vein graft failure 1,2,3,4. De aanhoudende toename van schuifspanning en cyclische rek induceert het pro-inflammatoire fenotype van menselijke veneuze veneuze endotheelcellen (hSVECs)3,4,5,6. De onderliggende moleculaire routes zijn nog steeds niet volledig begrepen en gestandaardiseerde protocollen voor in vitro studies kunnen de inspanningen voor nieuwe inzichten in het gebied benutten. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om hSVECs te isoleren, te karakteriseren en uit te breiden en hoe ze bloot te stellen aan variabele niveaus van schuifspanning en cyclische rek, waarbij de veneuze en arteriële hemodynamische omstandigheden worden nagebootst.
hSVECs worden geïsoleerd door collagenase-incubatie en kunnen worden gebruikt tot passage 8. Dit protocol vereist minder manipulatie van het vat in vergelijking met de andere beschikbare protocollen7, die besmetting met gladde spiercellen en fibroblasten vermindert. Aan de andere kant vereist het een groter vaatsegment van ten minste 2 cm om een efficiënte EC-extractie te hebben. In de literatuur is gemeld dat EC's uit grote vaten ook kunnen worden verkregen door mechanische verwijdering 7,8. Hoewel effectief, heeft de fysieke aanpak de nadelen van een lage EC-opbrengst en een hogere fibroblastbesmetting. Om de zuiverheid te verhogen, zijn extra stappen nodig met behulp van magnetische kralen of celsortering, waardoor de kosten van het protocol toenemen als gevolg van de verwerving van kralen en antilichamen 7,8. De enzymatische methode heeft snellere en betere resultaten met betrekking tot eg-zuiverheid en levensvatbaarheid 7,8.
De meest gebruikte EC's om endotheeldisfunctie te bestuderen zijn menselijke navelstreng endotheliale cellen (HUVECs). Het is bekend dat het EC-fenotype verandert in verschillende vaatbedden en het is essentieel om methoden te ontwikkelen die het onderzochte vat vertegenwoordigen 9,10. In dit opzicht is de vaststelling van een protocol om een hSVEC te isoleren en te kweken onder mechanische stress een waardevol hulpmiddel om de bijdrage van hSVEC-disfunctie bij adertransplantaatziekte te begrijpen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

Coronaire bypass graft (CABG) chirurgie is een procedure om ischemisch myocardium te revasculariseren. Saphenous ader blijft gebruikt als een CABG-kanaal ondanks de verminderde doorgankelijkheid op lange termijn in vergelijking met arteriële leidingen. De abrupte toename van hemodynamische stress geassocieerd met de graft arterialisatie resulteert in vasculaire schade, vooral het endotheel, die de lage doorgankelijkheid van het saphenous vein graft (SVG) kan beïnvloeden. Hier beschrijven we de isolatie, karakterisering en uitbreiding van menselijke vena-endotheelcellen (hSVECs). Cellen geïsoleerd door collagenasevertering vertonen de typische kasseimorfologie en drukken endotheelcelmarkers CD31 en VE-cadherine uit. Om de mechanische spanningsinvloed te beoordelen, werden in deze studie protocollen gebruikt om de twee belangrijkste fysieke stimuli, schuifspanning en stretch, op gearterialiseerde SVG's te onderzoeken. hSVECs worden gekweekt in een parallelle plaatstroomkamer om schuifspanning te produceren, met uitlijning in de richting van de stroom en verhoogde expressie van KLF2, KLF4 en NOS3. hSVECs kunnen ook worden gekweekt in een siliciummembraan dat gecontroleerde cellulaire stretch mogelijk maakt die veneuze (lage) en arteriële (hoge) rek nabootst. Het F-actinepatroon van endotheelcellen en de secretie van stikstofmonoxide (NO) worden dienovereenkomstig gemoduleerd door de arteriële rek. Samenvattend presenteren we een gedetailleerde methode om hSVECs te isoleren om de invloed van hemodynamische mechanische stress op een endotheelfenotype te bestuderen.

Meestal kunnen aangehechte EC's 3-4 dagen na extractie worden waargenomen. hSVECs vormen aanvankelijk clusters van cellen en vertonen een typische "kassei" morfologie (figuur 1B). Ze drukken de EG-markers CD31 (figuur 1C,D) en VE-cadherine (figuur 1D) uit. hSVECs kunnen gemakkelijk worden vermeerderd op een niet-gecoate behandelde celkweekschaal en ze behouden het endotheelfenotype in cultuur tot acht passages.
...

Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

We beschrijven een protocol om menselijke venaeuze veneuze endotheelcellen (hSVECs) te isoleren en te kweken. We bieden ook gedetailleerde methoden om schuifspanning en rek te produceren om mechanische spanning in hSVECs te bestuderen.

Isolatie van menselijke sapheneuze ader-endotheelcellen en blootstelling aan gecontroleerde niveaus van schuifspanning en rek

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

De vena saphena wordt plotseling blootgesteld aan arteriële aandoeningen na een coronaire bypass-operatie. Het begrijpen van de aanpassingsreactie op mechanische stress kan helpen bij het ontwerpen van therapeutische hulpmiddelen om adertransplantaatfalen te voorkomen. Dit endotheelcelisolatieprotocol is heel eenvoudig en vereist alleen incubatie met collagenase.Met minimale vaatmanipulatie resulteert dit in verminderde besmetting met gladde spiercellen en fibroblasten. Het protocol voor het isoleren van menselijke SVECs en het kweken ervan onder schuifspanning en cyclische rek is essentieel om de bijdrage van mechanische krachten in endotheelceldisfunctie geassocieerd met falen van sapheneuze adertransplantaten te begrijpen. Eerdere endotheelcelcultuur is zeer veeleisend in termen van celmediasupplementen.Het is verplicht om groeifactoren toe te voegen om een cultuur, de menselijke SVECs, met succes te isoleren. Voor het isoleren van primaire menselijke vena endotheliale cellen of menselijke SVECs, verzamel ten minste een twee tot drie centimeter lang saphenous adersegment. Werk onder een steriele laminaire stromingskap en breng het adersegment over naar een petrischaal gevuld met voorverwarmde PBS.Om al het bloed uit het lumen te verwijderen, plaatst u een pipetpunt die aan een pipet is bevestigd en gevuld met PBS in het ene uiteinde van de ader en spoelt u deze voorzichtig door. Spoel het door totdat de wasstroom volledig helder is. Sluit vervolgens het ene uiteinde van de ader met een steriele katoenen hechting.Vul het vat voorzichtig met één milligram per milliliter collagenase type 2-oplossing en sluit het andere uiteinde van het vat met een katoenen hechtdraad. Incubeer het vat met collagenase-oplossing in een bevochtigde atmosfeer van 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Snijd vervolgens het ene uiteinde van het vat over een buis van 15 milliliter om de collagenase-oplossing te verzamelen voordat u het andere uiteinde snijdt.Spoel het luminale oppervlak met één tot twee milliliter PBS om alle losgemaakte endotheelcellen in de buis te verzamelen met collagenase. Centrifugeer de buis op 400G in kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Na het verwijderen van het supernatant, suspensie de celpellet opnieuw in drie tot vier milliliter volledig endotheelcelmedium met een extra heparine-oplossing.Plaats de cellen in een celkweekschaal van 60 millimeter, voorgecoat met 3% gewicht per volume gelatine. Incubeer de cellen in een bevochtigde atmosfeer gedurende vier dagen zonder het medium te veranderen. Verander daarna het medium om de andere dag zonder de heparinesuppletie toe te voegen.Onderzoek de plaat onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de rode bloedcellen zijn verwijderd. Na één tot vier dagen na extractie, afhankelijk van de grootte en diameter van het adersegment, visualiseert u de menselijke SVECs door fasecontrastmicroscopie om de mate van samenvloeiing en hun kasseimorfologie te evalueren. Blijf de media om de twee dagen veranderen totdat de cellen 70% tot 80% confluentie bereiken.Bedek de schuif met 0,1% gewicht per volume gelatine en incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij 37 graden Celsius. Om de vloeistofeenheid en de steriele perfusieset met reservoirs van 10 millimeter in evenwicht te brengen, incubeer je die 's nachts in een bevochtigde atmosfeer. Voor het schuifspanningsexperiment zaait u 200.000 endotheelcellen gesuspendeerd in 100 microliter kweekmedium in de met gelatine gecoate stroomkamer.Voor het bevestigen van de cellen aan het kweekoppervlak, incubeer de cellen gedurende vier uur. Plaats de perfusieset op de fluidic unit. Vul de reservoirs en de perfusieset met ongeveer 12 milliliter voorverwarmd compleet endotheelcelmedium.Verwijder luchtbellen uit de perfusieset om het niveau van beide reservoirs op vijf milliliter in evenwicht te brengen. Plaats de vloeistofeenheid op de gemonteerde perfusieset zonder dat de kamer in de incubator schuift en sluit de elektrische kabel aan op de computergestuurde pomp. Door het vooraf gedefinieerde protocol in de pompbesturingssoftware uit te voeren, verwijdert u alle luchtbellen uit de reservoirs en de perfusieset.Neem de fluidic unit met de gemonteerde perfusieset op de laminaire flowkap en bevestig de dia's met een confluence cell monolayer. Nadat u de hele unit met de dia's in de couveuse hebt geplaatst, sluit u de elektrische kabel aan op de pomp. Pas in de pompbesturingssoftware de instelling van de vloeistofeenheid aan door het type dia te selecteren en de viscositeit van het medium in te stellen.Voer in stroomparameters de afschuifspanningswaarde in en stel de cyclusduur en het debiettype in. Klik vervolgens op de afspeelknop om het experiment te starten. Vergeet niet om de dia te onderhouden met cellen die zijn behandeld met dezelfde media zonder blootstelling aan stroming als statische controles.Breng glijmiddel op siliconenbasis aan op de boven- en zijkanten van het 25-millimeter 6-well equibiaxiale laadstation. Zaai 400.000 cellen gesuspendeerd in drie milliliter aan elke put van de 6-well flexible-bottomed kweekplaten bedekt met collageen één. Incubeer de cellen in bevochtigde lucht totdat ze 100% confluency bereiken.Voordat u met het stretchprotocol begint, wast u de cellen eenmaal met voorverwarmde PBS en voegt u drie milliliter vers kweekmedium per put toe. Plaats de basisplaat met alle gesmeerde laadstations in de incubator en sluit de slang op de juiste manier aan op de controllerapparatuur van het bi-bioreactorsysteem voor spanningscellen. Bevestig elke kweekplaat aan één rode pakking die door het bioreactorsysteem wordt geleverd.Plaats ze vervolgens in de bodemplaat in de couveuse. Plaats alle vier de kweekplaten in de basisplaat om de juiste vacuüm- en rekbelasting te bereiken. Schakel de controllerapparatuur en het computersysteem in.Open de FlexCell-besturingssoftware en configureer het gewenste regime, inclusief het percentage rek, golfvormvorm, frequentie en tijd. Bewaar het regime. Schakel het vacuümsysteem in, selecteer vervolgens het regime en klik op start op het computerscherm om het uitrekken uit te voeren.Controleer of het siliconenmembraan de cellen beweegt en uitrekt. De aangehechte endotheelcellen konden 4 tot 10 dagen na de extractie worden waargenomen. Ze vormen aanvankelijk celclusters met een typische kasseimorfologie.Zij drukten de EG-markers CD31 en VE-cadherine uit. De hSVECs bij kweek onder schuifspanning uitgelijnd in de richting van de stroming. De schuifspanning van 20 dynes per vierkante centimeter gedurende 72 uur induceert de expressie van typische mechanosensitieve genen, KLF2, KLF4 en NOS3, wat de effectiviteit van de schuifprikkel aangeeft.De cyclische rekuitkomst hing af van de intensiteit die werd toegepast op de menselijke SVECs. Cellen onder lage rek vertoonden een corticale F-actinepatroon vergelijkbaar met statische cellen. Zonder verandering in de afgifte van stikstofmonoxide gedurende maximaal 72 uur, hebben onze arteriële niveaus van stretch het actinecytoskelet na 24 uur gemodelleerd en na 72 uur de NO-afgifte verlaagd.Naast mechanische stressstudies kunnen onderzoekers de geïsoleerde cellen gebruiken om verschillende methoden uit te voeren om de kennis van de endotheelcelfunctie en disfunctie uit te breiden. Volgens het gedemonstreerde protocol is het mogelijk om elk ander type endotheelcellen te bestuderen onder schuifspanning en rek.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantatie van een carotis Cuff voor het activeren van Shear-stress geïnduceerde atherosclerose in Muizen

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-Dimensionale kunstharsproducten en beeldvorming van de muis Portal Vein of Intrahepatische Bile Duct System

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Gecontroleerde Cervicale Laceration Letsel in Muizen

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Gemodificeerd<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Assay naar de mogelijke rol van hormonen, cytokines en / of groeifactoren in Bemiddelen Cancer Cell Invasion Bepaal

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human aderen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusie en Externe Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolatie en Cultuur Uitbreiding van Tumor-specifieke endotheelcellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolatie en Cultuur van primaire endotheelcellen van Canine slagaders en aders

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...