Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

JEK wird durch Zuschüsse der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 und 2013/17368-0] und des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 und 309179/2013-0) unterstützt. AAM wird durch Zuschüsse der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) und des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9) unterstützt.

Ungenutzte Segmente der Vena saphena wurden von Patienten entnommen, die sich am Herzinstitut (InCor) der Medizinischen Fakultät der Universität von São Paulo einer aortokoronaren Bypass-Operation unterzogen. Alle Personen gaben ihre Einwilligung zur Teilnahme an der Studie, die von der örtlichen Ethikkommission geprüft und genehmigt wurde.
1. Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären humanen Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs)
<ol><li>Präparat<...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

Das Venensegment saphena sollte mindestens 2 cm groß sein, um hSVECs erfolgreich zu isolieren. Kleine Segmente sind schwer zu handhaben und binden die Enden des Gefäßes zusammen, um die Kollagenaselösung zu erhalten und die Zellen zu isolieren. Die reduzierte luminale Oberfläche liefert nicht genügend Zellen, um die Kultur zu erweitern. Um das Risiko einer Kontamination mit Nicht-ECs zu minimieren, muss die Manipulation des Venenabschnitts saphena während des gesamten Eingriffs sehr schonend erfolgen. Es ist wicht...

Die Dysfunktion der Endothelzellen (EC) ist ein wichtiger Faktor beim Versagen des Venentransplantatssaphena 1,2,3,4. Die anhaltende Zunahme der Scherspannung und der zyklischen Dehnung induziert den proinflammatorischen Phänotyp der humanen Saphena-Endothelzellen (hSVECs)3,4,5,6. Die zugrunde liegenden molekularen Signalwege sind noch nicht vollständig verstanden, und standardisierte Protokolle für In-vitro-Studien könnten die Bemühungen um neue Erkenntnisse auf diesem Gebiet unterstützen. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Isolierung, Charakterisierung und Expansion von hSVECs und wie sie unterschiedlichen Scherbelastungen und zyklischen Dehnungen ausgesetzt werden können, um die venösen und arteriellen hämodynamischen Bedingungen nachzuahmen.
hSVECs werden durch Kollagenase-Inkubation isoliert und können bis zur Passage 8 verwendet werden. Dieses Protokoll erfordert im Vergleich zu den anderen verfügbaren Protokollen weniger Manipulation des Gefäßes7, was die Kontamination mit glatten Muskelzellen und Fibroblasten reduziert. Andererseits ist ein größeres Gefäßsegment von mindestens 2 cm erforderlich, um eine effiziente EC-Extraktion zu erreichen. In der Literatur wurde berichtet, dass ECs aus großen Gefäßen auch durch mechanische Entfernung gewonnen werden können 7,8. Obwohl der physikalische Ansatz effektiv ist, hat er die Nachteile einer niedrigen EC-Ausbeute und einer höheren Fibroblastenkontamination. Um die Reinheit zu erhöhen, sind zusätzliche Schritte mit magnetischen Beads oder Zellsortierung erforderlich, was die Kosten des Protokolls aufgrund des Erwerbs von Beads und Antikörpern erhöht 7,8. Die enzymatische Methode führt zu schnelleren und besseren Ergebnissen in Bezug auf EC-Reinheit und Lebensfähigkeit 7,8.
Die am häufigsten verwendeten ECs zur Untersuchung der endothelialen Dysfunktion sind humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs). Es ist bekannt, dass sich der EC-Phänotyp in verschiedenen Gefäßbetten ändert, und es ist wichtig, Methoden zu entwickeln, die das untersuchte Gefäß darstellen 9,10. In dieser Hinsicht ist die Etablierung eines Protokolls zur Isolierung eines hSVEC und seiner Kultivierung unter mechanischer Belastung ein wertvolles Werkzeug, um den Beitrag der hSVEC-Dysfunktion bei Venentransplantaterkrankungen zu verstehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

Die Koronararterien-Bypass-Transplantation (CABG) ist ein Verfahren zur Revaskularisierung des ischämischen Myokards. Die Vena saphena wird trotz der im Vergleich zu arteriellen Conduits reduzierten Langzeitdurchgängigkeit weiterhin als CABG-Conduit verwendet. Der abrupte Anstieg des hämodynamischen Stresses, der mit der Arterialisierung des Transplantats einhergeht, führt zu einer Schädigung der Gefäße, insbesondere des Endothels, die die geringe Durchgängigkeit des Venentransplantats saphena (SVG) beeinflussen kann. Hier beschreiben wir die Isolierung, Charakterisierung und Expansion von humanen Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Zellen, die durch Kollagenaseverdau isoliert wurden, weisen die typische Kopfsteinpflastermorphologie auf und exprimieren die Endothelzellmarker CD31 und VE-Cadherin. Um den Einfluss der mechanischen Beanspruchung zu beurteilen, wurden in dieser Studie Protokolle verwendet, um die beiden wichtigsten physikalischen Stimuli, Scherspannung und Dehnung, auf arteriale SVGs zu untersuchen. hSVECs werden in einer parallelen Plattenströmungskammer kultiviert, um Scherspannungen zu erzeugen, die eine Ausrichtung in Strömungsrichtung und eine erhöhte Expression von KLF2, KLF4 und NOS3 zeigen. hSVECs können auch in einer Siliziummembran kultiviert werden, die eine kontrollierte Zelldehnung ermöglicht, die venöse (niedrige) und arterielle (hohe) Dehnung nachahmt. Das F-Aktin-Muster der Endothelzellen und die Stickstoffmonoxid (NO)-Sekretion werden entsprechend durch die arterielle Dehnung moduliert. Zusammenfassend stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung von hSVECs vor, um den Einfluss von hämodynamischem mechanischem Stress auf einen endothelialen Phänotyp zu untersuchen.

Typischerweise können verklebte ECs 3-4 Tage nach der Extraktion beobachtet werden. hSVECs bilden zunächst Zellhaufen und weisen eine typische "Kopfsteinpflaster"-Morphologie auf (Abbildung 1B). Sie exprimieren die EC-Marker CD31 (Abbildung 1C,D) und VE-Cadherin (Abbildung 1D). hSVECs können leicht auf einer unbeschichteten, behandelten Zellkulturschale vermehrt werden und behalten den endothelialen Phänotyp in ...

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Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung humaner Endothelzellen der Vena saphena (hSVECs). Wir stellen auch detaillierte Methoden zur Erzeugung von Scherspannung und Dehnung zur Verfügung, um mechanische Spannungen in hSVECs zu untersuchen.

Humane Endothelzellisolierung der Vena saphena und Exposition bei kontrollierter Scherspannung und Dehnung

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Die Vena saphena ist nach einer Bypass-Operation der Koronararterien plötzlich arteriellen Erkrankungen ausgesetzt. Das Verständnis seiner Anpassungsreaktion an mechanische Belastungen kann dazu beitragen, therapeutische Instrumente zu entwickeln, um das Versagen eines Venentransplantats zu verhindern. Dieses Protokoll zur Isolierung von Endothelzellen ist sehr einfach und erfordert nur eine Inkubation mit Kollagenase.Bei minimaler Gefäßmanipulation führt dies zu einer reduzierten Kontamination mit glatten Muskelzellen und Fibroblasten. Das Protokoll für die Isolierung humaner SVECs und deren Kultivierung unter Scherbelastung und zyklischer Dehnung ist unerlässlich, um den Beitrag mechanischer Kräfte bei der Dysfunktion von Endothelzellen im Zusammenhang mit dem Versagen des Venentransplantats saphena zu verstehen. Die vorherige Endothelzellkultur ist sehr anspruchsvoll in Bezug auf die Supplementierung mit Zellmedien.Es ist zwingend erforderlich, Wachstumsfaktoren hinzuzufügen, um eine Kultur, die menschlichen SVECs, erfolgreich zu isolieren. Für die Isolierung von primären humanen Endothelzellen der Vena saphena oder humanen SVECs wird ein mindestens zwei bis drei Zentimeter langes Venensegment der Vena saphena entnommen. Übertragen Sie das Venensegment unter einer sterilen Laminar-Flow-Haube in eine Petrischale, die mit vorgewärmtem PBS gefüllt ist.Um das gesamte Blut aus dem Lumen zu entfernen, führen Sie eine Pipettenspitze, die an einer Pipette befestigt und mit PBS gefüllt ist, in ein Ende der Vene ein und spülen Sie sie vorsichtig aus. Spülen Sie es, bis der Waschfluss vollständig klar ist. Verschließen Sie dann ein Ende der Vene mit einer sterilen Baumwollnaht.Füllen Sie das Gefäß vorsichtig mit einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase-Typ-2-Lösung und verschließen Sie das andere Ende des Gefäßes mit einer Baumwollnaht. Inkubieren Sie das Gefäß mit Kollagenaselösung in einer befeuchteten Atmosphäre von 5%igem Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Schneiden Sie dann ein Ende des Gefäßes über ein 15-Milliliter-Röhrchen, um die Kollagenase-Lösung aufzufangen, bevor Sie das andere Ende durchschneiden.Spülen Sie die luminale Oberfläche mit ein bis zwei Millilitern PBS, um alle abgelösten Endothelzellen in der Röhre mit Kollagenase zu sammeln. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Nach dem Entfernen des Überstandes wird das Zellpellet in drei bis vier Millilitern vollständigem Endothelzellmedium mit einer zusätzlichen Heparinlösung wieder suspendiert.Legen Sie die Zellen in eine 60-Millimeter-Zellkulturschale, die mit 3 Gewichtsprozent Gelatine vorbeschichtet ist. Inkubieren Sie die Zellen vier Tage lang in befeuchteter Atmosphäre, ohne das Medium zu wechseln. Wechseln Sie danach das Medium jeden zweiten Tag, ohne die Heparin-Supplementierung hinzuzufügen.Untersuchen Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen entfernt wurden. Je nach Größe und Durchmesser des Venenabschnitts werden die humanen SVECs ein bis vier Tage nach der Extraktion mittels Phasenkontrastmikroskopie visualisiert, um den Grad der Konfluenz und ihre Kopfsteinpflastermorphologie zu beurteilen. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen.Den Objektträger der Strömungskammer mit 0,1 Gew.-% Gelatine bestreichen und mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Fluidikeinheit und das sterile Perfusionsset mit 10-Millimeter-Reservoirs auszugleichen, inkubieren Sie diese über Nacht in einer befeuchteten Atmosphäre. Für das Scherspannungsexperiment werden 200.000 Endothelzellen, die in 100 Mikrolitern Nährmedium suspendiert sind, in den gelatinebeschichteten Strömungskammerschieber eingesessen.Um die Zellen an der Kulturoberfläche zu befestigen, inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang. Setzen Sie das Perfusionsset auf die Fluidikeinheit. Füllen Sie die Reservoirs und das Perfusionsset mit ca. 12 Millilitern vorgewärmtem Endothelzellmedium.Entfernen Sie Luftblasen aus dem Perfusionsset, um den Füllstand beider Behälter bei fünf Millilitern auszugleichen. Setzen Sie die Fluidikeinheit auf das montierte Perfusionsset ohne Kammerschieber im Inkubator und schließen Sie das Stromkabel an die computergesteuerte Pumpe an. Entfernen Sie durch Ausführen des vordefinierten Protokolls in der Pumpensteuerungssoftware alle Luftblasen aus den Behältern und dem Perfusionsset.Nehmen Sie die Fluidikeinheit mit dem montierten Perfusionsset an die Laminar-Flow-Haube und befestigen Sie die Objektträger mit einer Konfluenzzellen-Monoschicht. Nachdem Sie das gesamte Gerät mit den Objektträgern in den Inkubator gestellt haben, schließen Sie das Stromkabel an die Pumpe an. Passen Sie in der Pumpensteuerungssoftware die Einrichtung der Fluidikeinheit an, indem Sie den Schiebertyp auswählen und die Viskosität des Mediums einstellen.Geben Sie unter Strömungsparameter den Wert für die Schubspannung ein und legen Sie die Zyklusdauer und den Strömungstyp fest. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Abspielen", um das Experiment zu starten. Denken Sie daran, den Objektträger mit Zellen zu pflegen, die mit dem gleichen Medium behandelt wurden, ohne dem Durchfluss wie bei statischen Kontrollen ausgesetzt zu sein.Tragen Sie silikonbasiertes Schmiermittel auf die Oberseiten und Seiten der 25-Millimeter-6-Well-Beladestation auf. Säen Sie 400.000 Zellen, die in drei Millilitern suspendiert sind, in jede Vertiefung der 6-Well-Kulturplatten mit flexiblem Boden, die mit Kollagen beschichtet sind. Inkubieren Sie die Zellen in befeuchteter Luft, bis sie eine 100%ige Konfluenz erreichen.Bevor Sie mit dem Streckprotokoll beginnen, waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem PBS und fügen Sie drei Milliliter frisches Nährmedium pro Vertiefung hinzu. Setzen Sie die Grundplatte mit allen geschmierten Ladestationen in den Inkubator ein und verbinden Sie den Schlauch entsprechend mit der Steuerungsausrüstung des Spannzellen-Streckbioreaktorsystems. Befestigen Sie jede Kulturplatte an einer roten Dichtung, die vom Bioreaktorsystem bereitgestellt wird.Legen Sie sie dann in die Bodenplatte im Inkubator. Platzieren Sie alle vier Kulturplatten in der Grundplatte, um eine angemessene Vakuum- und Dehnungsbelastung zu erreichen. Schalten Sie die Controller-Geräte und das Computersystem ein.Öffnen Sie die FlexCell-Steuerungssoftware und konfigurieren Sie das gewünschte Regime, einschließlich des Prozentsatzes der Dehnung, der Wellenform, der Frequenz und der Zeit. Bewahren Sie die Kur auf. Schalten Sie das Vakuumsystem ein, wählen Sie dann das Programm aus und klicken Sie auf dem Computerbildschirm auf Start, um das Dehnen auszuführen.Überprüfen Sie, ob sich die Silikonmembran bewegt und die Zellen dehnt. Die adhäsiven Endothelzellen konnten 4 bis 10 Tage nach der Extraktion beobachtet werden. Sie bilden zunächst Zellhaufen, die eine typische Kopfsteinpflaster-Morphologie aufweisen.Sie exprimierten die EC-Marker CD31 und VE-Cadherin. Die hSVECs sind bei Kultivierung unter Scherbeanspruchung in Strömungsrichtung ausgerichtet. Die Scherspannung von 20 dyn pro Quadratzentimeter für 72 Stunden induziert die Expression der typischen mechanosensitiven Gene KLF2, KLF4 und NOS3, was auf die Wirksamkeit des Scherreizes hinweist.Das Ergebnis der zyklischen Dehnung hing von der Intensität ab, die auf die menschlichen SVECs angewendet wurde. Zellen mit geringer Dehnung zeigten ein kortikales F-Aktin-Muster, das statischen Zellen ähnelte. Ohne Veränderung der Stickoxidfreisetzung für bis zu 72 Stunden veränderten unsere arteriellen Dehnungsniveaus das Aktin-Zytoskelett nach 24 Stunden und verringerten die NO-Freisetzung nach 72 Stunden.Neben mechanischen Stressstudien können die Forscher die isolierten Zellen nutzen, um verschiedene Methoden durchzuführen, um das Wissen über die Funktion und Dysfunktion von Endothelzellen zu erweitern. Nach dem demonstrierten Protokoll ist es möglich, jede andere Art von Endothelzellen unter Scherbelastung und Dehnung zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Forschung

Medizin

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantation einer Karotis Cuff für Triggering Shear-Stress-Induced Arteriosklerose bei Mäusen

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-Dimensional Resin Casting und Imaging of Mouse Pfortader oder intrahepatische Gallengang-System

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Controlled Cervical Laceration Verletzungen in Mäuse

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Eine modifizierte<em&gt; In-vitro-</em&gt; Invasion Assay, um die mögliche Rolle von Hormonen, Cytokinen und / oder Wachstumsfaktoren bei der Vermittlung der Invasion von Krebszellen fest,

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

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Verfahren für Menschen V. saphena<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Perfusion und Außen Verstärkung

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

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Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

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Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...