Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

JEK נתמך על ידי מענקים מ- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ו- 2013/17368-0] ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ו- 309179/2013-0). AAM נתמך על ידי מענקים של Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (אוניברסלי - 407911/2021-9).

מקטעים לא בשימוש של ורידים ספניים התקבלו מחולים שעברו ניתוח מעקפים אבי העורקים במכון הלב (InCor), בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סאו פאולו. כל האנשים נתנו הסכמה מדעת להשתתף במחקר, אשר נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית.
1. בידוד, תרבית ואפיון של תאי אנדותל ראשוניים של ורידי?...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

מקטע הוורידים הספנוס צריך להיות לפחות 2 ס"מ כדי לבודד בהצלחה hSVECs. מקטעים קטנים קשים לטיפול וקושרים את קצות כלי הדם כדי לשמור על תמיסת הקולגנאז לבידוד התאים. שטח הפנים המואר המצומצם אינו מניב מספיק תאים כדי להרחיב את התרבית. כדי למזער את הסיכון של זיהום עם שאינם ECs, מניפולציה של קטע הווריד saphen...

תפקוד לקוי של תאי אנדותל (EC) הוא שחקן מפתח בכשל השתלת ורידים ספניים 1,2,3,4. העלייה המתמשכת של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית גורמת לפנוטיפ פרו-דלקתי של תאי אנדותל ורידים ספנוסיים אנושיים (hSVECs)3,4,5,6. המסלולים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם מובנים במלואם, ופרוטוקולים סטנדרטיים למחקרי מבחנה עשויים למנף את המאמצים לתובנות חדשות בתחום. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד, אפיון והרחבה של hSVECs וכיצד לחשוף אותם לרמות משתנות של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית, המחקה את התנאים ההמודינמיים הורידיים והעורקים.
hSVECs מבודדים על ידי דגירה של collagenase וניתן להשתמש בהם עד מעבר 8. פרוטוקול זה דורש פחות מניפולציה של כלי הדם בהשוואה לפרוטוקולים הזמינים האחרים7, אשר מפחית זיהום עם תאי שריר חלק ופיברובלסטים. מצד שני, זה דורש קטע כלי גדול יותר של לפחות 2 ס"מ כדי לקבל מיצוי EC יעיל. בספרות, דווח כי ECs מכלי גדול ניתן להשיג גם על ידי הסרה מכנית 7,8. למרות יעילותה, לגישה הפיזית יש את החסרונות של תפוקת EC נמוכה וזיהום פיברובלסטים גבוה יותר. כדי להגביר את הטוהר, נדרשים צעדים נוספים באמצעות חרוזים מגנטיים או מיון תאים, מה שמגדיל את עלות הפרוטוקול עקב רכישת חרוזים ונוגדנים 7,8. לשיטה האנזימטית יש תוצאות מהירות וטובות יותר לגבי טוהר EC וכדאיות 7,8.
ECs הנפוצים ביותר לחקר תפקוד לקוי של האנדותל הם תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). ידוע כי הפנוטיפ EC משתנה במיטות כלי דם שונות, וחיוני לפתח שיטות המייצגות את כלי השיט תחת חקירה 9,10. מבחינה זו, קביעת פרוטוקול לבידוד hSVEC ותרבית שלו תחת לחץ מכני היא כלי רב ערך להבנת התרומה של תפקוד לקוי של hSVEC במחלת השתלת ורידים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

ניתוח השתלת מעקף עורקים כליליים (CABG) הוא הליך לחידוש שריר הלב האיסכמי. וריד ספנוס נשאר בשימוש כצינור CABG למרות הפטנט המופחת לטווח ארוך בהשוואה לצינורות עורקים. העלייה הפתאומית של מתח המודינמי הקשור לעורק השתל גורמת לנזק לכלי הדם, במיוחד לאנדותל, שעשוי להשפיע על הפטנט הנמוך של שתל הווריד הספנוס (SVG). במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, האפיון וההרחבה של תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). תאים שבודדו על ידי עיכול collagenase מציגים את המורפולוגיה הטיפוסית של אבן מרוצפת ומבטאים סמני תאי אנדותל CD31 ו- VE-cadherin. כדי להעריך את השפעת הלחץ המכאני, נעשה שימוש בפרוטוקולים במחקר זה כדי לחקור את שני הגירויים הפיזיים העיקריים, לחץ גזירה ומתיחה, על SVGs עורקיים. hSVECs מתורבתים בתא זרימה מקביל של לוחות כדי לייצר לחץ גזירה, ומראים יישור בכיוון הזרימה וביטוי מוגבר של KLF2, KLF4 ו- NOS3. hSVECs ניתן גם לתרבית בקרום סיליקון המאפשר מתיחה תאית מבוקרת המחקה מתיחה ורידית (נמוכה) ועורקית (גבוהה). תבנית F-אקטין של תאי אנדותל והפרשת תחמוצת החנקן (NO) מווסתים בהתאם על ידי מתיחה עורקית. לסיכום, אנו מציגים שיטה מפורטת לבידוד hSVECs כדי לחקור את ההשפעה של לחץ מכני המודינמי על פנוטיפ אנדותל.

בדרך כלל, ECs דבק ניתן לראות 3-4 ימים לאחר החילוץ. hSVECs יוצרים בתחילה אשכולות של תאים ומציגים מורפולוגיה טיפוסית של "אבן מרוצפת" (איור 1B). הם מבטאים את סמני EC CD31 (איור 1C,D) ו-VE-cadherin (איור 1D). hSVECs יכולים להיות מופצים בקלות על צלחת תרבית תאים מט?...

Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). אנו מספקים גם שיטות מפורטות לייצור לחץ גזירה ומתיחה כדי לחקור לחץ מכני ב- hSVECs.

בידוד תאי אנדותל של וריד ספנוס אנושי וחשיפה לרמות מבוקרות של לחץ גזירה ומתיחה

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

הווריד הספנוס נחשף לפתע לתנאי עורקים לאחר ניתוח מעקפים של העורקים הכליליים. הבנת תגובת ההסתגלות שלו ללחץ מכני עשויה לסייע בתכנון כלים טיפוליים למניעת כשל השתלת ורידים. פרוטוקול בידוד תאי אנדותל זה הוא פשוט מאוד ודורש רק דגירה עם collagenase.עם מניפולציה מינימלית של כלי הדם, התוצאה היא זיהום מופחת עם תאי שריר חלקים ופיברובלסטים. הפרוטוקול לבידוד SVECs אנושיים ותרבית שלהם תחת לחץ גזירה ומתיחה מחזורית חיוני להבנת תרומתם של כוחות מכניים בתפקוד לקוי של תאי אנדותל הקשורים לכשל השתלת ורידים ספנוסיים. תרבית תאי אנדותל קודמת היא תובענית מאוד במונחים של תוספי מדיה תאית.חובה להוסיף גורמי גדילה כדי לבודד בהצלחה תרבות, ה- SVEC האנושיים. לבידוד תאי אנדותל ראשוניים של ורידים ספניים אנושיים או SVEC אנושיים, יש לאסוף לפחות מקטע ורידים ספניים באורך שניים עד שלושה סנטימטרים. עובדים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרי סטרילי, מעבירים את מקטע הוורידים לצלחת פטרי מלאה PBS שחומם מראש.כדי להסיר את כל הדם מתוך לומן, הכנס קצה פיפטה מחובר פיפטה מלא PBS לתוך קצה אחד של הווריד בעדינות לשטוף אותו. שוטפים אותו עד שזרימת הכביסה הופכת ברורה לחלוטין. ואז לסגור קצה אחד של הווריד עם תפר כותנה סטרילי.בזהירות למלא את הכלי עם מיליגרם אחד לכל מיליליטר collagenase סוג 2 פתרון ולסגור את הקצה השני של הכלי עם תפר כותנה. לדגור על הכלי עם תמיסת collagenase באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן חותכים קצה אחד של הכלי מעל צינור של 15 מיליליטר כדי לאסוף את תמיסת הקולגנאז לפני חיתוך הקצה השני.שטפו את המשטח הלומינלי במיליליטר אחד או שניים של PBS כדי לאסוף את כל תאי האנדותל המנותקים בתוך הצינור עם קולגן. צנטריפוגג את הצינור ב 400G בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את גלולת התא בשלושה עד ארבעה מיליליטרים של תווך תאי אנדותל שלם המכיל תמיסת הפרין נוספת.מקציפים את התאים בצלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ המצופה מראש בג'לטין במשקל 3% לכל נפח. לדגור על התאים באטמוספירה לחה במשך ארבעה ימים מבלי לשנות את התווך. לאחר מכן, לשנות את המדיום כל יומיים מבלי להוסיף את תוספת הפרין.בדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שתאי הדם האדומים הוסרו. לאחר יום עד ארבעה ימים לאחר החילוץ, בהתאם לגודל וקוטר של קטע הווריד, לדמיין את SVECs האנושי על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להעריך את מידת המפגש ואת המורפולוגיה מרוצפת שלהם. המשך לשנות את המדיה כל יומיים עד שהתאים מגיעים למפגש של 70% עד 80%.מצפים את תא הזרימה בג'לטין במשקל 0.1% לכל נפח ודגרים במשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי לאזן את היחידה הפלואידית ואת מערכת הזילוח הסטרילית בעלת מאגרים של 10 מילימטר, דגרו עליהם למשך הלילה באטמוספירה לחה. עבור ניסוי עקת הגזירה, זרע 200, 000 תאי אנדותל מרחפים ב -100 מיקרוליטר של תווך תרבית לתוך תא זרימה מצופה ג'לטין.לצורך הצמדת התאים למשטח התרבית, דוגרים על התאים במשך ארבע שעות. מניחים את ערכת הזילוח על היחידה הפלואידית. מלאו את המאגרים ואת ערכת הזילוח בכ-12 מיליליטר של תווך תאי אנדותל שלמים שחוממו מראש.הסר בועות אוויר מהזילוח שנקבע כדי לאזן את רמת שני המאגרים בחמישה מיליליטר. הניחו את יחידת הנוזל על מערכת הזילוח המותקנת ללא החלקת התא באינקובטור וחברו את כבל החשמל שלה למשאבה המווסתת על ידי מחשב. על ידי הפעלת הפרוטוקול שהוגדר מראש בתוכנת בקרת המשאבה, הסר את כל בועות האוויר מהמאגרים וממערך הזילוח.קח את היחידה הנוזלית עם זילוח רכוב להגדיר מכסה המנוע זרימה למינרית ולחבר את שקופיות שיש monolayer תא מפגש. לאחר הנחת היחידה כולה עם המגלשות באינקובטור, חבר את כבל החשמל שלה למשאבה. בתוכנת בקרת המשאבה, התאם את הגדרת היחידה הפלוידית על ידי בחירת סוג השקופית והגדרת צמיגות המדיום.בפרמטרים של זרימה, הזן את ערך מתח הגזירה והגדר את משך המחזור ואת סוג הזרימה. לאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה כדי להתחיל את הניסוי. זכור לתחזק את השקופית עם תאים המטופלים באותה מדיה ללא חשיפה לזרימה כפקדים סטטיים.יש למרוח חומר סיכה על בסיס סיליקון על החלק העליון והדפנות של תחנת ההעמסה השווה בקוטר 25 מ"מ עם 6 בארות. זרע 400, 000 תאים מרחפים בשלושה מיליליטר לכל באר של 6 צלחות תרבית בעלות תחתית גמישה המצופה בקולגן אחד. דוגרים על התאים באוויר לח עד שהם מגיעים למפגש של 100%.לפני תחילת פרוטוקול המתיחה, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS שחומם מראש והוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום תרבית טרי לכל באר. הכנס את צלחת הבסיס עם כל תחנות הטעינה המשומנות באינקובטור וחבר כראוי את הצינור עם ציוד הבקר של מערכת הביוריאקטור המתיחה של תא המתח. חברו כל צלחת תרבית לאטם אדום אחד המסופק על ידי מערכת הביוריאקטורים.ואז לשים אותם לתוך צלחת הבסיס באינקובטור. הניחו את כל ארבע צלחות התרבית בצלחת הבסיס כדי להשיג ואקום ועומס מתיחה מתאימים. הפעל את ציוד הבקר ואת מערכת המחשב.פתח את תוכנת הבקרה FlexCell והגדר את משטר האימונים הרצוי כולל אחוז ההתארכות, צורת הגל, התדר והזמן. שמור את המשטר. הפעל את מערכת הוואקום, ולאחר מכן בחר את משטר האחסון ולחץ על התחל במסך המחשב כדי להפעיל את המתיחה.בדקו שקרום הסיליקון זז ומותח את התאים. ניתן היה לצפות בתאי האנדותל הדבוקים 4 עד 10 ימים לאחר החילוץ. בתחילה הם יוצרים צבירי תאים המציגים מורפולוגיה טיפוסית של אבני ריצוף.הם ביטאו את סמני EC CD31 ו- VE-cadherin. hSVECs כאשר תרבית תחת לחץ גזירה מיושרים בכיוון הזרימה. לחץ הגזירה של 20 דינים לסמ"ר במשך 72 שעות גורם לביטוי של גנים אופייניים למכנורגישים, KLF2, KLF4 ו-NOS3, מה שמצביע על יעילות גירוי הגזירה.תוצאת המתיחה המחזורית הייתה תלויה בעוצמה שהוחלה על SVEC האנושיים. תאים מתחת למתיחה נמוכה הראו דפוס F-actin קליפת המוח דומה לתאים סטטיים. ללא שינוי בשחרור תחמוצת החנקן למשך עד 72 שעות, רמות המתיחה העורקיות שלנו שיפצו את שלד האקטין לאחר 24 שעות והפחיתו את שחרור NO לאחר 72 שעות.מלבד מחקרי לחץ מכניים, חוקרים יכולים להשתמש בתאים המבודדים כדי לבצע שיטות שונות להרחבת הידע על תפקוד תאי אנדותל ותפקוד לקוי. בעקבות הפרוטוקול שהודגם, ניתן לחקור כל סוג אחר של תאי אנדותל תחת לחץ גזירה ומתיחה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

השרשה של קאף הראש מפעילה שאר מתח טרשת עורקים המושרה עכברים

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

יציקה והדמיה של וריד שער מאוס או מערכת צינור מרת intrahepatic שרף 3-Dimensional

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

פגיעה קריעת צוואר הרחם מבוקרת בעכברים

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

נוהל saphenous אדם הוורידים<em&gt; Ex Vivo</em&gt; זלוף וחיצוני חיזוק

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...