Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
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जेईके को फंडाको डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो [एफएपीईएसपी-आईएनसीटी-20214/50889-7 और 2013/17368-0] और कॉन्सेलो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोजिको-सीएनपीक्यू (आईएनसीटी-465586/2014-7 और 309179-2014-20) से अनुदान द्वारा समर्थित है। एएएम को फंडाको डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (एफएपीईएसपी 2015/11139-5) और कॉन्सेलो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोजिको-सीएनपीक्यू (यूनिवर्सल - 407911/2021-9) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है।

साओ पाउलो मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय के हार्ट इंस्टीट्यूट (इनकोर) में ओर्टोकोरोनरी बाईपास सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से सफेनोस नसों के अप्रयुक्त खंड प्राप्त किए गए थे। सभी व्यक्तियों ने अध्ययन म?...

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	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

एचएसवीईसी को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए सफेनोस नस सेगमेंट कम से कम 2 सेमी होना चाहिए। कोशिकाओं को अलग करने के लिए कोलेजनेस समाधान को बनाए रखने के लिए पोत के सिरों को संभालना और बांधना मुश्किल होता है। ?...

एंडोथेलियल सेल (ईसी) डिसफंक्शन सफेनोस नस ग्राफ्ट विफलता 1,2,3,4 में एक महत्वपूर्ण खिलाड़ी है। कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव की निरंतर वृद्धि मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) 3,4,5,6 के प्रोइन्फ्लेमेटरी फेनोटाइप को प्रेरित करती है। अंतर्निहित आणविक मार्ग अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आए हैं, और इन विट्रो अध्ययनों के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल क्षेत्र में नवीन अंतर्दृष्टि के प्रयासों का लाभ उठा सकते हैं। यहां, हम एचएसवीईसी को अलग करने, चिह्नित करने और विस्तारित करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और उन्हें शिरापरक और धमनी हेमोडायनामिक स्थितियों की नकल करते हुए कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के परिवर्तनीय स्तरों को कैसे उजागर किया जाए।
एचएसवीईसी को कोलेजनेज इनक्यूबेशन द्वारा अलग किया जाता है और इसका उपयोग 8 तक किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य उपलब्ध प्रोटोकॉल7 की तुलना में पोत के कम हेरफेर की आवश्यकता होती है, जो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के साथ संदूषण को कम करता है। दूसरी ओर, कुशल ईसी निष्कर्षण के लिए कम से कम 2 सेमी के बड़े पोत खंड की आवश्यकता होती है। साहित्य में, यह बताया गया है कि बड़े जहाजों से ईसी को यांत्रिक हटाने 7,8 द्वारा भी प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि प्रभावी, भौतिक दृष्टिकोण में कम ईसी उपज और उच्च फाइब्रोब्लास्ट संदूषण के नुकसान हैं। शुद्धता बढ़ाने के लिए, चुंबकीय मोतियों या सेल सॉर्टिंग का उपयोग करके अतिरिक्त कदमों की आवश्यकता होती है, जिससे मोती और एंटीबॉडी 7,8 के अधिग्रहण के कारण प्रोटोकॉल की लागत बढ़ जाती है। एंजाइमेटिक विधि में ईसी शुद्धता और व्यवहार्यता 7,8 के बारे में तेज और बेहतर परिणाम हैं।
एंडोथेलियल डिसफंक्शन का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक बार इस्तेमाल किए जाने वाले ईसीएस मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचयूवीईसी) हैं। यह ज्ञात है कि ईसी फेनोटाइप विभिन्न संवहनी बिस्तरों में बदलता है, और उन तरीकों को विकसित करना आवश्यक है जो जांच के तहत पोत का प्रतिनिधित्व करते हैं 9,10। इस संबंध में, एचएसवीईसी को अलग करने और यांत्रिक तनाव के तहत इसे कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना नस ग्राफ्ट रोग में एचएसवीईसी शिथिलता के योगदान को समझने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्ट (सीएबीजी) सर्जरी इस्केमिक मायोकार्डियम को पुनर्जीवित करने की एक प्रक्रिया है। धमनी नाली की तुलना में कम दीर्घकालिक पैटेंसी के बावजूद सफेनोस नस का उपयोग सीएबीजी नाली के रूप में किया जाता है। ग्राफ्ट धमनीकरण से जुड़े हेमोडायनामिक तनाव की अचानक वृद्धि के परिणामस्वरूप संवहनी क्षति, विशेष रूप से एंडोथेलियम, जो सफेनोस नस ग्राफ्ट (एसवीजी) की कम पैटेंसी को प्रभावित कर सकती है। यहां, हम मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) के अलगाव, लक्षण वर्णन और विस्तार का वर्णन करते हैं। कोलेजनेस पाचन द्वारा पृथक कोशिकाएं विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती हैं और एंडोथेलियल सेल मार्कर सीडी 31 और वीई-कैडरिन को व्यक्त करती हैं। यांत्रिक तनाव प्रभाव का आकलन करने के लिए, इस अध्ययन में दो मुख्य शारीरिक उत्तेजनाओं, कतरनी तनाव और खिंचाव की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया था। एचएसवीईसी को कतरनी तनाव पैदा करने के लिए एक समानांतर प्लेट प्रवाह कक्ष में सुसंस्कृत किया जाता है, जो प्रवाह की दिशा में संरेखण दिखाता है और केएलएफ 2, केएलएफ 4 और एनओएस 3 की अभिव्यक्ति में वृद्धि करता है। एचएसवीईसी को सिलिकॉन झिल्ली में भी सुसंस्कृत किया जा सकता है जो शिरापरक (कम) और धमनी (उच्च) खिंचाव की नकल करते हुए नियंत्रित सेलुलर खिंचाव की अनुमति देता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं के एफ-एक्टिन पैटर्न और नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) स्राव को धमनी खिंचाव द्वारा तदनुसार संशोधित किया जाता है। सारांश में, हम एंडोथेलियल फेनोटाइप पर हेमोडायनामिक यांत्रिक तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एचएसवीईसी को अलग करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं।

आमतौर पर, निष्कर्षण के 3-4 दिन बाद पालन किए गए ईसी देखे जा सकते हैं। एचएसवीईसी शुरू में कोशिकाओं के समूह बनाते हैं और एक विशिष्ट "कोबलस्टोन" आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 1 बी)। वे ईसी ...

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Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

हम मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचएसवीईसी) को अलग करने और कल्चर करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एचएसवीईसी में यांत्रिक तनाव का अध्ययन करने के लिए कतरनी तनाव और खिंचाव का उत्पादन करने के लिए विस्तृत तरीके भी प्रदान करते हैं।

मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल सेल अलगाव और कतरनी तनाव और खिंचाव के नियंत्रित स्तर के संपर्क में

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

कोरोनरी धमनी बाईपास सर्जरी के बाद सफेनोस नस अचानक धमनी की स्थिति के संपर्क में आती है। यांत्रिक तनाव के लिए इसकी अनुकूलन प्रतिक्रिया को समझना नस ग्राफ्ट विफलता को रोकने के लिए चिकित्सीय उपकरण डिजाइन करने में मदद कर सकता है। यह एंडोथेलियल सेल अलगाव प्रोटोकॉल बहुत सरल है और केवल कोलेजनेज के साथ इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है।न्यूनतम पोत हेरफेर के साथ, इसके परिणामस्वरूप चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के साथ संदूषण कम हो जाता है। मानव एसवीईसी को अलग करने और उन्हें कतरनी तनाव और चक्रीय खिंचाव के तहत कल्चर करने के लिए प्रोटोकॉल सैफेनोस नस ग्राफ्ट विफलता से जुड़े एंडोथेलियल सेल डिसफंक्शन में यांत्रिक बलों के योगदान को समझने के लिए आवश्यक है। सेल मीडिया की खुराक के संदर्भ में पूर्व एंडोथेलियल सेल संस्कृति बहुत मांग है।एक संस्कृति, मानव एसवीईसी को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए विकास कारकों को जोड़ना अनिवार्य है। प्राथमिक मानव सफेनोस नस एंडोथेलियल कोशिकाओं या मानव एसवीईसी को अलग करने के लिए, कम से कम दो से तीन सेंटीमीटर लंबी सफेनोस नस खंड एकत्र करें। एक बाँझ लामिनर प्रवाह हुड के तहत काम करते हुए, नस खंड को पूर्व-गर्म पीबीएस से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।लुमेन के अंदर से सभी रक्त को हटाने के लिए, एक पिपेट से जुड़ी एक पिपेट टिप डालें और पीबीएस से भरे हुए नस के एक छोर में डालें और धीरे से इसे फ्लश करें। इसे तब तक फ्लश करें जब तक कि धोने का प्रवाह पूरी तरह से स्पष्ट न हो जाए। फिर एक बाँझ कपास सीवन के साथ नस के एक छोर को बंद करें।सावधानी से बर्तन को एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर कोलेजनेस टाइप 2 घोल से भरें और बर्तन के दूसरे छोर को कपास सीवन से बंद कर दें। एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% कार्बन डाइऑक्साइड के ह्यूमिडिफायर वातावरण में कोलेजनेस समाधान के साथ बर्तन को इनक्यूबेट करें। फिर दूसरे छोर को काटने से पहले कोलेजनेस समाधान को इकट्ठा करने के लिए 15-मिलीलीटर ट्यूब पर पोत के एक छोर को काट लें।कोलेजनेस के साथ ट्यूब के अंदर सभी अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक से दो मिलीलीटर पीबीएस के साथ ल्यूमिनल सतह को फ्लश करें। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान में 400 ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटाने के बाद, एक अतिरिक्त हेपरिन समाधान युक्त पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम के तीन से चार मिलीलीटर में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।कोशिकाओं को 60-मिलीमीटर सेल कल्चर डिश में 3% वजन प्रति वॉल्यूम जिलेटिन के साथ प्री-लेपित करें। माध्यम को बदले बिना चार दिनों के लिए एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। उसके बाद, हेपरिन पूरकता को जोड़े बिना हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि लाल रक्त कोशिकाओं को हटा दिया गया था। निष्कर्षण के एक से चार दिनों के बाद, नस खंड के आकार और व्यास के आधार पर, संगम की डिग्री और उनके कोबलस्टोन आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा मानव एसवीईसी की कल्पना करें। हर दो दिनों में मीडिया को बदलना जारी रखें जब तक कि कोशिकाएं 70% से 80% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं।प्रवाह कक्ष स्लाइड को 0.1% वजन प्रति मात्रा जिलेटिन के साथ कोट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 10 मिलीमीटर जलाशयों वाले फ्लूइडिक यूनिट और बाँझ छिड़काव सेट को संतुलित करने के लिए, उन्हें रात भर एक ह्यूमिडिफायर वातावरण में इनक्यूबेट करें। कतरनी तनाव प्रयोग के लिए, बीज 200, 000 एंडोथेलियल कोशिकाओं को जिलेटिन-लेपित प्रवाह कक्ष स्लाइड में 100 माइक्रोलीटर संस्कृति माध्यम में निलंबित कर दिया गया।कोशिकाओं को संस्कृति की सतह से जोड़ने के लिए, कोशिकाओं को चार घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। छिड़काव सेट को तरल इकाई पर रखें। जलाशयों और छिड़काव सेट को लगभग 12 मिलीलीटर पूर्व-गर्म पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम से भरें।पांच मिलीलीटर पर दोनों जलाशयों के स्तर को बराबर करने के लिए छिड़काव सेट से हवा के बुलबुले निकालें। इनक्यूबेटर में चैंबर स्लाइड के बिना माउंटेड छिड़काव सेट पर फ्लूडिक यूनिट रखें और इसके इलेक्ट्रिक केबल को कंप्यूटर-विनियमित पंप से कनेक्ट करें। पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में पूर्व-परिभाषित प्रोटोकॉल चलाकर, जलाशयों और छिड़काव सेट से सभी हवा के बुलबुले हटा दें।माउंटेड परफ्यूजन सेट के साथ फ्लुइडिक यूनिट को लैमिनर फ्लो हुड में ले जाएं और एक संगम सेल मोनोलेयर वाली स्लाइड्स संलग्न करें। इनक्यूबेटर में स्लाइड के साथ पूरी यूनिट रखने के बाद, इसके विद्युत केबल को पंप से कनेक्ट करें। पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, स्लाइड के प्रकार का चयन करके और माध्यम की चिपचिपाहट सेट करके फ्लुइडिक यूनिट सेटअप को समायोजित करें।प्रवाह मापदंडों में, कतरनी तनाव मान दर्ज करें और चक्र अवधि और प्रवाह प्रकार सेट करें। फिर प्रयोग शुरू करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करें। स्थैतिक नियंत्रण के रूप में प्रवाह के संपर्क में आए बिना एक ही मीडिया के साथ इलाज की गई कोशिकाओं के साथ स्लाइड को बनाए रखना याद रखें।25-मिलीमीटर 6-अच्छी तरह से समअक्षीय लोडिंग स्टेशन के शीर्ष और किनारों पर सिलिकॉन-आधारित स्नेहक लागू करें। कोलेजन के साथ लेपित 6-अच्छी तरह से लचीली-तल वाली संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक कुएं में तीन मिलीलीटर में 400,000 कोशिकाओं को निलंबित किया गया। कोशिकाओं को ह्यूमिडिफायर हवा में तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि वे 100% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं।खिंचाव प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, कोशिकाओं को एक बार पहले से गर्म पीबीएस से धो लें और प्रति अच्छी तरह से तीन मिलीलीटर ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें। इनक्यूबेटर में सभी स्नेहन लोडिंग स्टेशनों के साथ बेस प्लेट डालें और तनाव सेल स्ट्रेचिंग बायोरिएक्टर सिस्टम के नियंत्रक उपकरण के साथ टयूबिंग को उचित रूप से कनेक्ट करें। प्रत्येक कल्चर प्लेट को बायोरिएक्टर सिस्टम द्वारा प्रदान किए गए एक लाल गैसकेट में संलग्न करें।फिर उन्हें इनक्यूबेटर में बेस प्लेट में रखें। उचित वैक्यूम और स्ट्रेचिंग लोड प्राप्त करने के लिए सभी चार कल्चर प्लेटों को बेस प्लेट में रखें। नियंत्रक उपकरण और कंप्यूटर सिस्टम चालू करें।फ्लेक्ससेल नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें और बढ़ाव के प्रतिशत, तरंग आकार, आवृत्ति और समय सहित वांछित आहार कॉन्फ़िगर करें। आहार को बचाएं। वैक्यूम सिस्टम चालू करें, फिर आहार का चयन करें और स्ट्रेचिंग चलाने के लिए कंप्यूटर स्क्रीन पर स्टार्ट पर क्लिक करें।जांचें कि सिलिकॉन झिल्ली कोशिकाओं को स्थानांतरित और खींच रही है। निष्कर्षण के 4 से 10 दिन बाद पालन किए गए एंडोथेलियल कोशिकाओं को देखा जा सकता है। वे शुरू में एक विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने वाले सेल क्लस्टर बनाते हैं।उन्होंने ईसी मार्कर सीडी 31 और वीई-कैडरिन व्यक्त किए। एचएसवीईसी जब कतरनी तनाव के तहत सुसंस्कृत होते हैं तो प्रवाह की दिशा में संरेखित होते हैं। 72 घंटों के लिए प्रति वर्ग सेंटीमीटर 20 डायने का कतरनी तनाव विशिष्ट मेकेनोसेंसेटिव जीन, केएलएफ 2, केएलएफ 4 और एनओएस 3 की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जो कतरनी उत्तेजना की प्रभावशीलता का संकेत देता है।चक्रीय खिंचाव परिणाम मानव एसवीईसी पर लागू तीव्रता पर निर्भर करता है। कम खिंचाव के तहत कोशिकाओं ने स्थैतिक कोशिकाओं के समान एक कॉर्टिकल एफ-एक्टिन पैटर्न दिखाया। 72 घंटे तक नाइट्रिक ऑक्साइड रिलीज में बदलाव के बिना, खिंचाव के हमारे धमनी स्तर ने 24 घंटे के बाद एक्टिन साइटोस्केलेटन को फिर से तैयार किया और 72 घंटों के बाद कोई रिलीज नहीं हुई।यांत्रिक तनाव अध्ययन के अलावा, शोधकर्ता एंडोथेलियल सेल फ़ंक्शन और डिसफंक्शन के ज्ञान का विस्तार करने के लिए विभिन्न तरीकों को करने के लिए पृथक कोशिकाओं का उपयोग कर सकते हैं। प्रदर्शित प्रोटोकॉल के बाद, कतरनी तनाव और खिंचाव के तहत किसी अन्य प्रकार की एंडोथेलियल कोशिकाओं का अध्ययन करना संभव है।

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

एयर तरल इंटरफेस पर माउस श्वसन उपकला कोशिकाओं और प्रायोगिक सिगरेट धूम्रपान करने के लिए एक्सपोजर के अलगाव

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

एक मन्या गिरफ्तार चूहे में कतरें तनाव प्रेरित Atherosclerosis ट्रिगर करने के लिए आरोपण

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3 आयामी राल कास्टिंग और माउस पोर्टल नस या intrahepatic पित्त नली प्रणाली की इमेजिंग

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

चूहे में नियंत्रित सरवाइकल पंगु बनाना चोट

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

मानव भ्रूण अग्नाशय सेल समूहों के अलगाव, संस्कृति, और इमेजिंग

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

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एक संशोधित<em&gt; इन विट्रो</em&gt; आक्रमण परख हार्मोन, मध्यस्थता कैंसर सेल आक्रमण में साइटोकिन्स और / या वृद्धि कारकों की संभावित भूमिका निर्धारित करने के लिए

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

मानव saphenous नसों के लिए प्रक्रिया<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; छिड़काव और बाहरी सुदृढीकरण

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

मल्टी पैरामीटर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा मानव लिम्फेटिक endothelial कोशिकाओं का अलगाव

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

ट्यूमर विशिष्ट endothelial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के विस्तार

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

अलगाव और कुत्ते धमनियों और नसों से प्राथमिक endothelial कोशिकाओं की संस्कृति

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...