Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
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JEK è sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 e 2013/17368-0] e del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 e 309179/2013-0). AAM è sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) e del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Segmenti inutilizzati di vene safene sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia di bypass aortocoronarico presso l'Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Tutti gli individui hanno dato il consenso informato a partecipare allo studio, che è stato esaminato e approvato dal comitato etico locale.
1. Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule endoteliali primarie della vena safena umana (hSVECs)
<ol><li>Preparazione<ol><li>Autoclav...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

Il segmento della vena safena deve essere di almeno 2 cm per isolare con successo le hSVEC. Piccoli segmenti sono difficili da gestire e legano le estremità del vaso per mantenere la soluzione di collagenasi per isolare le cellule. La ridotta superficie luminale non produce cellule sufficienti per espandere la coltura. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione con non-EC, la manipolazione del segmento della vena safena deve essere molto delicata durante l'intera procedura. È importante prestare attenzione quan...

La disfunzione delle cellule endoteliali (EC) è un attore chiave nel fallimento dell'innesto di vena safena 1,2,3,4. L'aumento sostenuto dello sforzo di taglio e dello stiramento ciclico induce il fenotipo proinfiammatorio delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC)3,4,5,6. I percorsi molecolari sottostanti non sono ancora completamente compresi e protocolli standardizzati per studi in vitro possono sfruttare gli sforzi per nuove intuizioni nell'area. Qui, descriviamo un semplice protocollo per isolare, caratterizzare ed espandere le hSVEC e come esporle a livelli variabili di stress da taglio e allungamento ciclico, imitando le condizioni emodinamiche venose e arteriose.
Le hSVEC sono isolate mediante incubazione della collagenasi e possono essere utilizzate fino al passaggio 8. Questo protocollo richiede meno manipolazione del vaso rispetto agli altri protocolli disponibili7, che riduce la contaminazione con cellule muscolari lisce e fibroblasti. D'altra parte, richiede un segmento di vaso più grande di almeno 2 cm per avere un'estrazione EC efficiente. In letteratura, è stato riportato che le EC da grandi navi possono anche essere ottenute mediante rimozione meccanica 7,8. Sebbene efficace, l'approccio fisico presenta gli svantaggi di una bassa resa EC e di una maggiore contaminazione da fibroblasti. Per aumentare la purezza, sono necessari ulteriori passaggi utilizzando sfere magnetiche o smistamento cellulare, aumentando il costo del protocollo a causa dell'acquisizione di perline e anticorpi 7,8. Il metodo enzimatico ha risultati più rapidi e migliori per quanto riguarda la purezza e la vitalità CE 7,8.
Le EC più frequentemente utilizzate per studiare la disfunzione endoteliale sono le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). È noto che il fenotipo EC cambia in diversi letti vascolari, ed è essenziale sviluppare metodi che rappresentino il vaso in esame 9,10. A questo proposito, l'istituzione di un protocollo per isolare una hSVEC e coltivarla sotto stress meccanico è uno strumento prezioso per comprendere il contributo della disfunzione hSVEC nella malattia del trapianto venoso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

La chirurgia dell'innesto di bypass coronarico (CABG) è una procedura per rivascolarizzare il miocardio ischemico. La vena safena rimane utilizzata come condotto CABG nonostante la ridotta pervietà a lungo termine rispetto ai condotti arteriosi. Il brusco aumento dello stress emodinamico associato all'arterializzazione dell'innesto provoca danni vascolari, in particolare l'endotelio, che possono influenzare la bassa pervietà dell'innesto della vena safena (SVG). Qui, descriviamo l'isolamento, la caratterizzazione e l'espansione delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Le cellule isolate dalla digestione della collagenasi mostrano la tipica morfologia del ciottolo ed esprimono i marcatori delle cellule endoteliali CD31 e VE-caderina. Per valutare l'influenza dello stress meccanico, in questo studio sono stati utilizzati protocolli per studiare i due principali stimoli fisici, sforzo di taglio e allungamento, su SVG arterializzati. Le hSVEC sono coltivate in una camera di flusso a piastre parallele per produrre stress di taglio, mostrando allineamento nella direzione del flusso e una maggiore espressione di KLF2, KLF4 e NOS3. Le hSVEC possono anche essere coltivate in una membrana di silicio che consente l'allungamento cellulare controllato che imita l'allungamento venoso (basso) e arterioso (alto). Il pattern F-actina delle cellule endoteliali e la secrezione di ossido nitrico (NO) sono modulati di conseguenza dall'allungamento arterioso. In sintesi, presentiamo un metodo dettagliato per isolare le hSVEC per studiare l'influenza dello stress meccanico emodinamico su un fenotipo endoteliale.

Tipicamente, le EC aderenti possono essere osservate 3-4 giorni dopo l'estrazione. Le hSVEC formano inizialmente gruppi di cellule e mostrano una tipica morfologia "ciottolata" (Figura 1B). Esprimono i marcatori EC CD31 (Figura 1C,D) e VE-caderina (Figura 1D). Le hSVEC possono essere facilmente propagate su un piatto di coltura cellulare trattata non rivestita e mantengono il fenotipo endoteliale in coltura fino a o...

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Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Forniamo anche metodi dettagliati per produrre stress di taglio e allungamento per studiare lo stress meccanico nelle hSVEC.

Vena safena umana Isolamento delle cellule endoteliali ed esposizione a livelli controllati di stress da taglio e allungamento

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

La vena safena viene improvvisamente esposta a condizioni arteriose dopo un intervento chirurgico di bypass coronarico. Comprendere la sua risposta di adattamento allo stress meccanico può aiutare a progettare strumenti terapeutici per prevenire il fallimento dell'innesto venoso. Questo protocollo di isolamento delle cellule endoteliali è molto semplice e richiede solo l'incubazione con collagenasi.Con una manipolazione minima dei vasi, ciò si traduce in una ridotta contaminazione con cellule muscolari lisce e fibroblasti. Il protocollo per isolare le SVEC umane e coltivarle sotto sforzo di taglio e allungamento ciclico è essenziale per comprendere il contributo delle forze meccaniche nella disfunzione delle cellule endoteliali associate al fallimento dell'innesto di vena safena. La precedente coltura di cellule endoteliali è molto esigente in termini di integratori di supporti cellulari.È obbligatorio aggiungere fattori di crescita per isolare con successo una cultura, le SVEC umane. Per isolare le cellule endoteliali primarie della vena safena umana o le SVEC umane, raccogliere almeno un segmento di vena safena lungo almeno due-tre centimetri. Lavorando sotto una cappa a flusso laminare sterile, trasferire il segmento di vena in una capsula di Petri riempita con PBS preriscaldato.Per rimuovere tutto il sangue dall'interno del lume, inserire una punta di pipetta attaccata a una pipetta e riempita con PBS in un'estremità della vena e sciacquarla delicatamente. Sciacquare fino a quando il flusso di lavaggio diventa completamente chiaro. Quindi chiudere un'estremità della vena con una sutura di cotone sterile.Riempire con cura la nave con una soluzione di collagenasi di tipo 2 da un milligrammo per millilitro e chiudere l'altra estremità della nave con una sutura di cotone. Incubare il recipiente con una soluzione di collagenasi in un'atmosfera umidificata di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi tagliare un'estremità della nave su un tubo da 15 millilitri per raccogliere la soluzione di collagenasi prima di tagliare l'altra estremità.Lavare la superficie luminale con uno o due millilitri di PBS per raccogliere tutte le cellule endoteliali distaccate all'interno del tubo con collagenasi. Centrifugare il tubo a 400G a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet cellulare in tre o quattro millilitri di mezzo cellulare endoteliale completo contenente un'ulteriore soluzione di eparina.Placcare le cellule in un piatto di coltura cellulare da 60 millimetri pre-rivestito con gelatina al 3% di peso per volume. Incubare le cellule in atmosfera umidificata per quattro giorni senza cambiare il mezzo. Successivamente, cambiare il mezzo a giorni alterni senza aggiungere l'integrazione di eparina.Esaminare la piastra al microscopio per assicurarsi che i globuli rossi siano stati rimossi. Dopo uno o quattro giorni dall'estrazione, a seconda delle dimensioni e del diametro del segmento venoso, visualizzare le SVEC umane mediante microscopia a contrasto di fase per valutare il grado di confluenza e la loro morfologia del ciottolo. Continuare a cambiare il supporto ogni due giorni fino a quando le celle raggiungono il 70% all'80% di confluenza.Rivestire il vetrino della camera di flusso con gelatina allo 0,1% di peso per volume e incubare per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius. Per equilibrare l'unità fluidica e il set di perfusione sterile con serbatoi da 10 millimetri, incubarli durante la notte in un'atmosfera umidificata. Per l'esperimento di sforzo di taglio, seminare 200.000 cellule endoteliali sospese in 100 microlitri di terreno di coltura nel vetrino della camera di flusso rivestito di gelatina.Per attaccare le cellule alla superficie della coltura, incubare le cellule per quattro ore. Posizionare il set di perfusione sull'unità fluidica. Riempire i serbatoi e il set di perfusione con circa 12 millilitri di mezzo cellulare endoteliale completo preriscaldato.Rimuovere le bolle d'aria dal set di perfusione per equilibrare il livello di entrambi i serbatoi a cinque millilitri. Posizionare l'unità fluidica sul set di perfusione montato senza la slitta della camera nell'incubatore e collegare il suo cavo elettrico alla pompa regolata dal computer. Eseguendo il protocollo predefinito nel software di controllo della pompa, rimuovere tutte le bolle d'aria dai serbatoi e dal set di perfusione.Prendere l'unità fluidica con la perfusione montata impostata sulla cappa a flusso laminare e fissare i vetrini aventi un monostrato a cella di confluenza. Dopo aver posizionato l'intera unità con le guide nell'incubatore, collegare il cavo elettrico alla pompa. Nel software di controllo della pompa, regolare la configurazione dell'unità fluidica selezionando il tipo di slitta e impostando la viscosità del fluido.Nei parametri di flusso, immettere il valore della sollecitazione di taglio e impostare la durata del ciclo e il tipo di flusso. Quindi fai clic sul pulsante di riproduzione per avviare l'esperimento. Ricordarsi di mantenere il vetrino con celle trattate con gli stessi supporti senza esposizione al flusso come controlli statici.Applicare lubrificante a base di silicone sulle parti superiori e laterali della stazione di carico equibiassiale a 6 pozzetti da 25 millimetri. Seme 400.000 cellule sospese in tre millilitri a ciascun pozzetto delle piastre di coltura a fondo flessibile a 6 pozzetti rivestite con collagene. Incubare le celle in aria umidificata fino a raggiungere il 100% di confluenza.Prima di iniziare il protocollo di allungamento, lavare le cellule una volta con PBS preriscaldato e aggiungere tre millilitri di terreno di coltura fresco per pozzetto. Inserire la piastra di base con tutte le stazioni di carico lubrificate nell'incubatore e collegare opportunamente il tubo con l'apparecchiatura di controllo del sistema di allungamento del bioreattore della cella di tensione. Attaccare ogni piastra di coltura a una guarnizione rossa fornita dal sistema del bioreattore.Quindi inserirli nella piastra di base nell'incubatore. Posizionare tutte e quattro le piastre di coltura nella piastra di base per ottenere il vuoto e il carico di allungamento adeguati. Accendere l'apparecchiatura del controller e il sistema informatico.Aprire il software di controllo FlexCell e configurare il regime desiderato includendo la percentuale di allungamento, la forma d'onda, la frequenza e il tempo. Salva il regime. Accendere il sistema di aspirazione, quindi selezionare il regime e fare clic su Start sullo schermo del computer per eseguire lo stretching.Controllare che la membrana di silicone si muova e allunghi le cellule. Le cellule endoteliali aderenti potrebbero essere osservate da 4 a 10 giorni dopo l'estrazione. Inizialmente formano gruppi di cellule che mostrano una tipica morfologia di ciottoli.Hanno espresso i marcatori EC CD31 e VE-caderina. Le hSVEC quando coltivate sotto sforzo di taglio si allineano nella direzione del flusso. Lo sforzo di taglio di 20 dynes per centimetro quadrato per 72 ore induce l'espressione di geni meccanosensibili tipici, KLF2, KLF4 e NOS3, indicando l'efficacia dello stimolo di taglio.Il risultato dell'allungamento ciclico dipendeva dall'intensità applicata alle SVEC umane. Le cellule a basso allungamento hanno mostrato un pattern corticale F-actina simile alle cellule statiche. Senza cambiamenti nel rilascio di ossido nitrico fino a 72 ore, i nostri livelli arteriosi di allungamento hanno rimodellato il citoscheletro di actina dopo 24 ore e diminuito il rilascio di NO dopo 72 ore.Oltre agli studi sullo stress meccanico, i ricercatori possono utilizzare le cellule isolate per eseguire vari metodi per espandere la conoscenza della funzione e della disfunzione delle cellule endoteliali. Seguendo il protocollo dimostrato, è possibile studiare qualsiasi altro tipo di cellule endoteliali sotto stress di taglio e stiramento.

Research

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