Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
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JEKは、サンパウロ国立科学財団(FAPESP-INCT-20214/50889-7および2013/17368-0)および国立科学芸術財団CNPq(INCT-465586/2014-7および309179/2013-0)からの助成金によって支援されています。AAMは、サンパウロ国立財団(FAPESP 2015/11139-5)およびコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ-CNPq(ユニバーサル-407911/2021-9)からの助成金によって支援されています。

伏在静脈の未使用のセグメントは、サンパウロ大学医学部の心臓研究所(InCor)で大動脈バイパス手術を受けている患者から得られました。すべての個人が研究に参加することにインフォームドコンセントを与え、地元の倫理委員会によってレビューおよび承認されました。
1. 初代ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の単離、培養、および特性評価
<ol><li>準備<ol><li>一...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

伏在静脈セグメントは、hSVECを正常に分離するために少なくとも2 cmである必要があります。小さなセグメントは、細胞を単離するためのコラゲナーゼ溶液を維持するために、取り扱いや血管の端を結ぶのが困難です。管腔表面積の減少は、培養を拡大するのに十分な細胞を生じさせない。非ECによる汚染のリスクを最小限に抑えるために、伏在静脈セグメントの操作は、手順全体を通して非?...

内皮細胞(EC)機能不全は、伏在静脈グラフト不全の重要なプレーヤーです1,2,3,4。せん断応力と周期的伸展の持続的な増加は、ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の炎症誘発性表現型を誘導します3,4,5,6。基礎となる分子経路はまだ完全には理解されておらず、in vitro研究のための標準化されたプロトコルは、この分野における新しい洞察のための努力を活用する可能性があります。ここでは、hSVECを単離、特性評価、拡張するための簡単なプロトコルと、静脈および動脈の血行動態状態を模倣して、hSVECをさまざまなレベルのせん断応力と周期的伸展にさらす方法について説明します。
hSVECはコラゲナーゼインキュベーションによって単離され、継代8まで使用することができます。このプロトコルは、平滑筋細胞および線維芽細胞による汚染を減少させる他の利用可能なプロトコル7と比較して、血管の操作が少なくて済む。一方、効率的なEC抽出を行うには、少なくとも2cmのより大きな血管セグメントが必要です。文献では、大型容器からのECは機械的除去によっても得られることが報告されています7,8。物理的アプローチは効果的であるが、EC収率が低く、線維芽細胞汚染が高いという欠点がある。純度を上げるには、磁気ビーズまたは細胞ソーティングを使用した追加のステップが必要であり、ビーズと抗体の取得によりプロトコルのコストが増加します7,8。酵素法は、ECの純度と生存率に関してより速く、より良い結果をもたらします7,8。
内皮機能障害の研究に最も頻繁に使用されるECは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)です。EC表現型は血管床によって変化することが知られており、調査中の血管を表す方法を開発することが不可欠である9,10。この点で、hSVECを単離し、機械的ストレス下で培養するためのプロトコルの確立は、静脈移植疾患におけるhSVEC機能障害の寄与を理解するための貴重なツールです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

冠動脈バイパスグラフト(CABG)手術は、虚血性心筋を血行再建する手順です。伏在静脈は、動脈導管と比較して長期的な開存性が低下しているにもかかわらず、CABG導管として使用され続けています。移植片動脈化に関連する血行動態ストレスの急激な増加は、伏在静脈移植片(SVG)の低い開存性に影響を与える可能性のある血管損傷、特に内皮をもたらします。ここでは、ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の単離、特性評価、および増殖について説明します。コラゲナーゼ消化によって単離された細胞は、典型的な石畳の形態を示し、内皮細胞マーカーCD31およびVE-cadherinを発現します。機械的ストレスの影響を評価するために、この研究ではプロトコルを使用して、動脈化されたSVGに対する2つの主要な物理的刺激であるせん断応力と伸張を調査しました。 hSVECは、平行プレートフローチャンバーで培養されてせん断応力を生成し、流れの方向に整列し、KLF2、KLF4、およびNOS3の発現が増加しました。hSVECは、静脈(低)および動脈(高)の伸展を模倣した細胞伸長を制御できるシリコン膜で培養することもできます。内皮細胞のF-アクチンパターンと一酸化窒素(NO)分泌は、動脈の伸展によってそれに応じて調節されます。要約すると、内皮表現型に対する血行力学的機械的ストレスの影響を研究するために、hSVECを単離するための詳細な方法を提示します。

典型的には、付着ECは抽出後3〜4日で観察することができる。hSVECは、最初は細胞のクラスターを形成し、典型的な「石畳」の形態を示します(図1B)。それらはECマーカーCD31(図1C、D)およびVE-カドヘリン(図1D)を発現する。hSVECは、コーティングされていない処理済み細胞培養皿上で容易に増殖することができ、培養?...

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Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)を単離および培養するためのプロトコルについて述べる。また、hSVECの機械的応力を研究するために、せん断応力と伸張を生成するための詳細な方法も提供しています。

ヒト伏在静脈内皮細胞の単離と制御されたレベルのせん断応力および伸張への曝露

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

伏在静脈は、冠状動脈バイパス手術後に突然動脈状態にさらされます。機械的ストレスに対するその適応応答を理解することは、静脈移植不全を予防するための治療ツールの設計に役立つ可能性があります。この内皮細胞単離プロトコルは非常にシンプルで、コラゲナーゼとのインキュベーションのみが必要です。最小限の血管操作で、平滑筋細胞や線維芽細胞による汚染が減少します。ヒトSVECを単離し、せん断応力および周期的伸展下で培養するためのプロトコルは、伏在静脈移植不全に関連する内皮細胞機能障害における機械力の寄与を理解するために不可欠です。以前の内皮細胞培養は、細胞培地の補充に関して非常に要求が厳しい。培養物であるヒトSVECをうまく分離するには、成長因子を追加することが必須です。初代ヒト伏在静脈内皮細胞またはヒトSVECを単離するために、少なくとも2〜3センチメートルの長さの伏在静脈セグメントを収集します。滅菌層流フードの下で作業し、静脈セグメントを予熱したPBSで満たされたペトリ皿に移します。内腔の内側からすべての血液を取り除くには、ピペットに取り付けられ、PBSで満たされたピペットチップを静脈の一端に挿入し、静かに洗い流します。洗浄の流れが完全に透明になるまで洗い流します。次に、滅菌綿縫合糸で静脈の一端を閉じます。容器に1ミリリットルあたり1ミリグラムのコラゲナーゼ2型溶液を慎重に満たし、容器のもう一方の端を綿縫合糸で閉じます。容器をコラゲナーゼ溶液とともに、5%二酸化炭素、摂氏37度の加湿雰囲気中で1時間インキュベートします。次に、15ミリリットルのチューブで容器の一方の端を切断し、もう一方の端を切断する前にコラゲナーゼ溶液を収集します。管腔表面を1〜2ミリリットルのPBSで洗い流し、チューブ内の剥離した内皮細胞をすべてコラゲナーゼで収集します。チューブを室温で400Gで5分間遠心分離します。上清を除去した後、追加のヘパリン溶液を含む3〜4ミリリットルの完全内皮細胞培地に細胞ペレットを再懸濁する。体積あたり3%重量ゼラチンでプレコートされた60mmの細胞培養皿に細胞をプレートします。培地を変更せずに加湿雰囲気中で4日間細胞をインキュベートします。その後、ヘパリンの補給を加えずに一日おきに培地を交換してください。顕微鏡でプレートを調べて、赤血球が除去されたことを確認します。抽出後1〜4日後、静脈セグメントのサイズと直径に応じて、位相差顕微鏡でヒトSVECを視覚化し、合流の程度とその玉石の形態を評価します。細胞が70%から80%のコンフルエントに達するまで、2日ごとに培地を交換し続けます。フローチャンバースライドを体積あたり0.1%重量ゼラチンでコーティングし、摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。10ミリメートルリザーバを有する流体ユニットと滅菌灌流セットとを平衡化するために、それらを加湿雰囲気中で一晩インキュベートする。せん断応力実験のために、100マイクロリットルの培養液に懸濁した200, 000個の内皮細胞をゼラチンコートフローチャンバースライドに播種した。細胞を培養表面に付着させるには、細胞を4時間インキュベートします。灌流セットを流体ユニットに配置します。リザーバーおよび灌流セットに、約12ミリリットルの予め温めた完全内皮細胞培地を充填する。灌流セットから気泡を取り除き、両方のリザーバーのレベルを5ミリリットルで平衡化します。インキュベーター内のチャンバースライドなしで、取り付けられた灌流セットに流体ユニットを置き、その電気ケーブルをコンピューター制御ポンプに接続します。ポンプ制御ソフトウェアで事前定義されたプロトコルを実行して、リザーバーと灌流セットからすべての気泡を取り除きます。灌流を層流フードにセットした流体ユニットを取り、コンフルエンスセル単層を有するスライドを取り付けます。スライド付きのユニット全体をインキュベーターに入れた後、その電気ケーブルをポンプに接続します。ポンプ制御ソフトウェアで、スライドの種類を選択し、媒体の粘度を設定して、流体ユニットのセットアップを調整します。[流れパラメータ]で、せん断応力値を入力し、サイクル期間と流れタイプを設定します。次に、再生ボタンをクリックして実験を開始します。静的コントロールとして流れにさらされることなく、同じ培地で処理された細胞でスライドを維持することを忘れないでください。シリコーンベースの潤滑剤を25ミリメートルの6ウェル等二軸ローディングステーションの上部と側面に塗布します。種子400, 000細胞をコラーゲン1でコーティングした6ウェルフレキシブルボトム培養プレートの各ウェルに3ミリリットルで懸濁した。細胞が100%コンフルエントに達するまで加湿空気中でインキュベートします。ストレッチプロトコルを開始する前に、予め温めたPBSで細胞を1回洗浄し、ウェルあたり3ミリリットルの新鮮な培地を加えます。すべての潤滑ローディングステーションを備えたベースプレートをインキュベーターに挿入し、チューブをテンションセルストレッチバイオリアクターシステムのコントローラー機器に適切に接続します。各培養プレートをバイオリアクターシステムが提供する1つの赤いガスケットに取り付けます。それからそれらをインキュベーターのベースプレートに入れます。4つの培養プレートすべてをベースプレートに配置して、適切な真空と伸張荷重を実現します。コントローラ機器とコンピュータシステムの電源を入れます。FlexCell制御ソフトウェアを開き、伸び率、波形形状、周波数、時間など、目的のレジメンを設定します。レジメンを保存します。真空システムの電源を入れ、レジメンを選択し、コンピューター画面で[開始]をクリックしてストレッチを実行します。シリコーン膜が細胞を動かして伸ばしていることを確認します。接着した内皮細胞は抽出後4〜10日目に観察できた。それらは最初に典型的な石畳の形態を示す細胞クラスターを形成します。ECマーカーCD31およびVEカドヘリンを発現させた。剪断応力下で培養した場合のhSVECsは流れの方向に整列した。20ダイン/平方センチメートルのせん断応力を72時間行うことで、代表的な機械感受性遺伝子であるKLF2、KLF4、NOS3の発現が誘導され、せん断刺激の有効性が示唆された。周期的伸展の結果は、ヒトSVECに加えられた強度に依存した。低伸長下の細胞は、静的細胞と同様の皮質F-アクチンパターンを示した。最大72時間一酸化窒素放出の変化なしに、私たちの動脈レベルのストレッチは24時間後にアクチン細胞骨格を再構築し、72時間後にNO放出を減少させました。機械的ストレスの研究に加えて、研究者は単離された細胞を使用して、内皮細胞の機能と機能障害に関する知識を拡大するためのさまざまな方法を実行できます。実証されたプロトコルに従って、せん断応力および伸張下で他のタイプの内皮細胞を研究することが可能です。

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

マウスでのせん断応力誘発アテローム性動脈硬化症をトリガするための頸動脈カフの注入

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3次元樹脂鋳造およびマウスの門脈や肝内胆管系の結

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

マウスで制御子宮裂傷の傷害

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

変更された<em&gt;インビトロ</em媒介する癌細胞浸潤におけるホルモン、サイトカインおよび/または成長因子の潜在的な役割を決定するために&gt;浸潤アッセイ

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

人間の伏在静脈のための手順<em&gt;生体外</em&gt;灌流および外部補強

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

マルチパラメータ蛍光活性化細胞選別によるヒトリンパ内皮細胞の単離

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

腫瘍特異的内皮細胞の単離および培養拡大

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

犬の動脈と静脈からの初代内皮細胞の単離および培養

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...