Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
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JEK는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 및 2013/17368-0] 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 및 309179/2013-0)의 보조금으로 지원됩니다. AAM은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo(FAPESP 2015/11139-5) 및 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq(Universal - 407911/2021-9)의 보조금으로 지원됩니다.

상파울루 의과대학 심장연구소(InCor)에서 대동맥관상동맥우회술을 받은 환자로부터 복재정맥의 미사용 부분을 채취하였다. 모든 개인은 지역 윤리 위원회에서 검토하고 승인한 연구 참여에 대해 정보에 입각한 동의를 했습니다.
1. 일차 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 분리, 배양 및 특성화
<ol><li>준비<ol><li>한 쌍의 직선 또는 곡선 집게와 조직 가위 (7-8cm)를 오...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

복재 정맥 분절은 hSVEC를 성공적으로 분리하기 위해 최소 2cm가 되어야 합니다. 작은 세그먼트는 다루기가 어렵고 세포를 분리하기 위해 콜라게나제 용액을 유지하기 위해 혈관의 끝을 묶습니다. 감소된 내강 표면적은 배양을 확장하기에 충분한 세포를 생성하지 않습니다. 비 EC로 인한 오염 위험을 최소화하려면 복재 정맥 부분의 조작이 전체 절차 동안 매우 부드럽게해야합니다. 혈액을 제거하기...

내피 세포 (EC) 기능 장애는 복재 정맥 이식 실패 1,2,3,4에서 핵심적인 역할을 한다. 전단 응력과 주기적 스트레칭의 지속적인 증가는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 전염증 표현형을 유도합니다3,4,5,6. 기본 분자 경로는 아직 완전히 이해되지 않았으며 시험관 내 연구를 위한 표준화된 프로토콜은 해당 분야의 새로운 통찰력을 위한 노력을 활용할 수 있습니다. 여기에서는 hSVEC를 분리, 특성화 및 확장하는 간단한 프로토콜과 정맥 및 동맥 혈역학적 조건을 모방하여 다양한 수준의 전단 응력 및 주기적 스트레치에 hSVEC를 노출시키는 방법을 설명합니다.
hSVEC는 콜라게나제 배양에 의해 분리되며 계대 8까지 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이용가능한 다른 프로토콜7에 비해 혈관 조작이 덜 필요하며, 이는 평활근 세포 및 섬유아세포에 의한 오염을 감소시킨다. 반면에 효율적인 EC 추출을 위해서는 최소 2cm의 더 큰 용기 세그먼트가 필요합니다. 문헌에서, 대형 용기로부터의 EC는 또한 기계적 제거에 의해서도 얻어질 수 있다고 보고되었다 7,8. 효과적이기는 하지만, 물리적 접근법은 낮은 EC 수율 및 더 높은 섬유아세포 오염의 단점을 갖는다. 순도를 높이려면 마그네틱 비드 또는 세포 분류를 사용하는 추가 단계가 필요하며, 비드 및 항체 획득으로 인한 프로토콜 비용이 증가합니다 7,8. 효소 방법은 EC 순도 및 생존력과 관련하여 더 빠르고 더 나은 결과를 나타냅니다 7,8.
내피 기능 장애를 연구하기 위해 가장 자주 사용되는 EC는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)입니다. EC 표현형은 상이한 혈관 층에서 변화하는 것으로 알려져 있으며, 조사중인 혈관을 나타내는 방법을 개발하는 것이 필수적이다 9,10. 이와 관련하여, hSVEC를 분리하고 기계적 스트레스 하에서 배양하기 위한 프로토콜의 확립은 정맥 이식 질환에서 hSVEC 기능 장애의 기여를 이해하는 데 유용한 도구입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

관상동맥우회술(CABG) 수술은 허혈성 심근을 혈관재생시키는 절차입니다. 복재 정맥은 동맥 도관에 비해 감소된 장기 개통성에도 불구하고 CABG 도관으로 계속 사용됩니다. 이식편 동맥화와 관련된 혈역학적 스트레스의 급격한 증가는 복재 정맥 이식편(SVG)의 낮은 개통성에 영향을 미칠 수 있는 혈관 손상, 특히 내피를 초래합니다. 여기에서 우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)의 분리, 특성화 및 확장에 대해 설명합니다. 콜라게나제 분해에 의해 분리된 세포는 전형적인 조약돌 형태를 나타내고 내피 세포 마커인 CD31 및 VE-cadherin을 발현합니다. 기계적 응력 영향을 평가하기 위해 이 연구에서 동맥화된 SVG에 대한 두 가지 주요 물리적 자극인 전단 응력과 스트레치를 조사하기 위해 프로토콜을 사용했습니다. hSVEC는 평행판 유동 챔버에서 배양되어 전단 응력을 생성하여 유동 방향으로의 정렬과 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현 증가를 보여줍니다. hSVEC는 또한 정맥(저) 및 동맥(고) 스트레칭을 모방하여 제어된 세포 스트레치를 허용하는 실리콘 멤브레인에서 배양될 수 있습니다. 내피 세포의 F-액틴 패턴과 산화질소(NO) 분비는 동맥 스트레칭에 의해 그에 따라 조절됩니다. 요약하면, 우리는 내피 표현형에 대한 혈역학적 기계적 스트레스의 영향을 연구하기 위해 hSVEC를 분리하는 자세한 방법을 제시합니다.

일반적으로 부착된 EC는 추출 후 3-4일 후에 관찰할 수 있습니다. hSVEC는 초기에 세포 클러스터를 형성하고 전형적인 "조약돌" 형태를 나타냅니다(그림 1B). 이들은 EC 마커 CD31(그림 1C,D) 및 VE-카데린(그림 1D)을 발현합니다. hSVEC는 코팅되지 않은 처리된 세포 배양 접시에서 쉽게 증식할 수 있으며 최대 8계대 배양에서 내?...

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Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 hSVEC의 기계적 응력을 연구하기 위해 전단 응력과 스트레치를 생성하는 자세한 방법을 제공합니다.

인간 복재 정맥 내피 세포 분리 및 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레칭에 대한 노출

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

복재 정맥은 관상 동맥 우회 수술 후 갑자기 동맥 상태에 노출됩니다. 기계적 스트레스에 대한 적응 반응을 이해하면 정맥 이식 실패를 예방하기 위한 치료 도구를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 내피 세포 분리 프로토콜은 매우 간단하며 콜라게나제와 함께 배양하기만 하면 됩니다.최소한의 혈관 조작으로 평활근 세포와 섬유아세포의 오염을 줄일 수 있습니다. 인간 SVEC를 분리하고 전단 응력 및 주기적 스트레칭 하에서 배양하기 위한 프로토콜은 복재 정맥 이식 실패와 관련된 내피 세포 기능 장애에서 기계적 힘의 기여를 이해하는 데 필수적입니다. 이전의 내피 세포 배양은 세포 배지 보충제 측면에서 매우 까다롭습니다.배양물인 인간 SVEC를 성공적으로 분리하기 위해서는 성장 인자를 추가하는 것이 필수적입니다. 일차 인간 복재 정맥 내피 세포 또는 인간 SVEC를 분리하기 위해 최소 2-3cm 길이의 복재 정맥 세그먼트를 수집합니다. 멸균 층류 후드 아래에서 작업하면서 정맥 세그먼트를 예열 된 PBS로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.내강 내부의 모든 혈액을 제거하려면 피펫에 부착되고 PBS로 채워진 피펫 팁을 정맥의 한쪽 끝에 삽입하고 부드럽게 씻어냅니다. 세탁 흐름이 완전히 깨끗해질 때까지 세척하십시오. 그런 다음 멸균 면봉사로 정맥의 한쪽 끝을 막습니다.용기에 밀리리터 콜라게나제 유형 2 용액 1 밀리그램을 조심스럽게 채우고 면봉사로 용기의 다른 쪽 끝을 닫습니다. 콜라게나제 용액으로 용기를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소의 가습 분위기에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용기의 한쪽 끝을 15밀리리터 튜브 위로 절단하여 다른 쪽 끝을 절단하기 전에 콜라게나제 용액을 수집합니다.1-2 밀리리터의 PBS로 내강 표면을 플러시하여 콜라겐 분해 효소로 튜브 내부의 모든 분리 된 내피 세포를 수집합니다. 튜브를 실온에서 400G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거한 후, 추가 헤파린 용액을 함유하는 3 내지 4 밀리리터의 완전한 내피 세포 배지에 세포 펠릿을 다시 현탁시킨다.부피당 3% 중량의 젤라틴으로 미리 코팅된 60mm 세포 배양 접시에 세포를 플레이트합니다. 배지를 변경하지 않고 4일 동안 가습된 분위기에서 세포를 배양합니다. 그 후, 헤파린 보충제를 추가하지 않고 격일로 배지를 변경하십시오.적혈구가 제거되었는지 확인하기 위해 현미경으로 플레이트를 검사합니다. 추출 후 1-4일 후, 정맥 세그먼트의 크기와 직경에 따라 위상차 현미경으로 인간 SVEC를 시각화하여 합류 정도와 조약돌 형태를 평가합니다. 세포가 70%에서 80%의 밀도에 도달할 때까지 이틀에 한 번씩 배지를 계속 교체합니다.유량 챔버 슬라이드를 부피당 0.1% 중량 젤라틴으로 코팅하고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다. 유체 유닛 및 10 밀리미터 저장조를 갖는 멸균 관류 세트를 평형화시키기 위해, 이들을 가습된 대기에서 밤새 배양한다. 전단 응력 실험을 위해, 200, 000 내피 세포를 100 마이크로리터의 배양 배지에 현탁시켜 젤라틴이 코팅된 유동 챔버 슬라이드 내로 시드하였다.세포를 배양 표면에 부착시키기 위해, 세포를 4시간 동안 배양한다. 유체 장치에 관류 세트를 놓습니다. 저장소와 관류 세트를 약 12 밀리리터의 예열 된 완전한 내피 세포 배지로 채 웁니다.관류 세트에서 기포를 제거하여 두 저장소의 수위를 5밀리리터로 평형을 이룹니다. 인큐베이터의 챔버 슬라이드 없이 장착된 관류 세트에 유체 장치를 놓고 전기 케이블을 컴퓨터 조절 펌프에 연결합니다. 펌프 제어 소프트웨어에서 사전 정의된 프로토콜을 실행하여 저장소와 관류 세트에서 모든 기포를 제거합니다.층류 후드에 장착된 관류 세트가 있는 유체 장치를 취하여 합류 셀 단층을 갖는 슬라이드를 부착합니다. 인큐베이터에 슬라이드가있는 전체 장치를 배치 한 후 전기 케이블을 펌프에 연결하십시오. 펌프 제어 소프트웨어에서 슬라이드 유형을 선택하고 매체의 점도를 설정하여 유체 장치 설정을 조정합니다.흐름 매개변수(Flow Parameters)에 전단 응력 값을 입력하고 사이클 지속 시간과 흐름 유형을 설정합니다. 그런 다음 재생 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다. 정적 대조군과 같은 흐름에 노출되지 않고 동일한 매체로 처리된 세포로 슬라이드를 유지하는 것을 잊지 마십시오.실리콘 기반 윤활유를 25mm 6웰 등이축 로딩 스테이션의 상단과 측면에 도포합니다. 종자 400, 000 세포를 콜라겐으로 코팅된 6-웰 유연 바닥 배양 플레이트의 각 웰에 3 밀리리터에 현탁시켰다. 세포가 100% 합류도에 도달할 때까지 가습된 공기에서 세포를 배양합니다.스트레치 프로토콜을 시작하기 전에, 예열된 PBS로 세포를 한 번 세척하고, 웰 당 3밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가한다. 인큐베이터에 윤활된 모든 로딩 스테이션이 있는 베이스 플레이트를 삽입하고 튜브를 텐션 셀 스트레칭 바이오리액터 시스템의 컨트롤러 장비와 적절하게 연결합니다. 각 배양 플레이트를 바이오리액터 시스템에서 제공하는 하나의 빨간색 개스킷에 부착합니다.그런 다음 인큐베이터의베이스 플레이트에 넣으십시오. 적절한 진공 및 스트레칭 부하를 얻기 위해 4개의 배양 플레이트를 모두 베이스 플레이트에 놓습니다. 컨트롤러 장비와 컴퓨터 시스템을 켭니다.FlexCell 제어 소프트웨어를 열고 연신율, 파형 모양, 주파수 및 시간의 백분율을 포함하여 원하는 요법을 구성합니다. 요법을 저장하십시오. 진공 시스템을 켠 다음 요법을 선택하고 컴퓨터 화면에서 시작을 클릭하여 스트레칭을 실행합니다.실리콘 멤브레인이 움직이고 셀을 늘리고 있는지 확인하십시오. 부착된 내피세포는 추출 후 4 내지 10일 후에 관찰할 수 있었다. 그들은 처음에 전형적인 조약돌 형태를 나타내는 세포 클러스터를 형성합니다.그들은 EC 마커 CD31과 VE-cadherin을 발현했습니다. hSVECs는 전단 응력 하에서 배양될 때 유동 방향으로 정렬된다. 72시간 동안 제곱센티미터당 20 다인의 전단 응력은 전형적인 기계 감응 유전자인 KLF2, KLF4 및 NOS3의 발현을 유도하여 전단 자극의 효과를 나타냅니다.주기적 스트레칭 결과는 인간 SVEC에 적용되는 강도에 따라 다릅니다. 낮은 스트레치 하의 세포는 정적 세포와 유사한 피질 F-액틴 패턴을 보였다. 최대 72시간 동안 산화질소 방출의 변화 없이, 우리의 동맥 스트레치 수준은 24시간 후에 액틴 세포 골격을 리모델링하고 72시간 후에 NO 방출을 감소시켰습니다.기계적 스트레스 연구 외에도 연구자들은 분리된 세포를 사용하여 내피 세포 기능 및 기능 장애에 대한 지식을 확장하기 위한 다양한 방법을 수행할 수 있습니다. 입증된 프로토콜에 따라 전단 응력 및 스트레칭 하에서 다른 유형의 내피 세포를 연구할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

연구

의학

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

마우스의 전단 응력 유발 죽상 경화증을 실행을위한 경동맥 혈압계의 주입

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3 차원 수지 주조 및 마우스 포털 정맥 또는 Intrahepatic의 담즙 덕트 시스템의 이미징

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

마우스의 제어 자궁 경부 열상 상해

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

인간의 태아 췌장 세포 클러스터의 분리, 문화, 및 이미징

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

수정<em&gt; 시험관</em&gt; 침공 분석은 호르몬, 중재 암 세포 침략의 사이토 카인 및 / 또는 성장 인자의 잠재적 인 역할을 확인하는

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

인간 복재 정맥 절차<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 관류 및 외부 보강

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...