Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

JEK støttes av tilskudd fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 og 2013/17368-0] og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 og 309179/2013-0). AAM støttes av tilskudd fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Ubrukte segmenter av saphenøse vener ble oppnådd fra pasienter som gjennomgår aortokoronar bypassoperasjon ved Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Alle ga informert samtykke til å delta i studien, som ble gjennomgått og godkjent av den lokale etiske komiteen.
1. Isolasjon, kultur og karakterisering av primære humane endotelceller i saphenøse vener (hSVECs)
<ol><li>Forberedelse<ol><li>Autoklav et par rette eller buede tang og vevsaks (7-8 ...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

Det saphenøse venesegmentet bør ha minst 2 cm for å kunne isolere hSVEC. Små segmenter er vanskelige å håndtere og binde endene av karet for å opprettholde kollagenaseoppløsningen for å isolere cellene. Det reduserte luminale overflatearealet gir ikke tilstrekkelige celler til å utvide kulturen. For å minimere risikoen for forurensning med ikke-EC, må manipuleringen av saphenøse venesegmentet være veldig forsiktig under hele prosedyren. Det er viktig å være forsiktig når pipettespissene føres inn i lumi...

Endotelcelle (EC) dysfunksjon er en nøkkelspiller i saphenøs venetransplantatsvikt 1,2,3,4. Den vedvarende økningen av skjærspenning og syklisk strekk induserer den proinflammatoriske fenotypen av humane endotelceller i saphenøse vene (hSVECs)3,4,5,6. De underliggende molekylære veiene er fortsatt ikke fullt ut forstått, og standardiserte protokoller for in vitro-studier kan utnytte innsatsen for ny innsikt i området. Her beskriver vi en enkel protokoll for å isolere, karakterisere og utvide hSVEC og hvordan de skal utsettes for variable nivåer av skjærspenning og syklisk strekk, som etterligner de venøse og arterielle hemodynamiske forholdene.
hSVEC isoleres ved kollagenaseinkubasjon og kan brukes frem til passasje 8. Denne protokollen krever mindre manipulering av fartøyet sammenlignet med de andre tilgjengelige protokollene7, noe som reduserer forurensning med glatte muskelceller og fibroblaster. På den annen side krever det et større fartøysegment på minst 2 cm for å ha effektiv EC-utvinning. I litteraturen er det rapportert at EC fra store fartøy også kan oppnås ved mekanisk fjerning 7,8. Selv om den er effektiv, har den fysiske tilnærmingen ulempene med lavt EC-utbytte og høyere fibroblastforurensning. For å øke renheten er det nødvendig med ekstra trinn ved hjelp av magnetiske perler eller cellesortering, noe som øker kostnadene for protokollen på grunn av oppkjøpet av perler og antistoffer 7,8. Den enzymatiske metoden har raskere og bedre resultater med hensyn til EC-renhet og levedyktighet 7,8.
De mest brukte ECene for å studere endoteldysfunksjon er humane endotelceller i navlestrengen (HUVEC). Det er kjent at EF-fenotypen endres i forskjellige vaskulære senger, og det er viktig å utvikle metoder som representerer fartøyet som undersøkes 9,10. I denne forbindelse er etableringen av en protokoll for å isolere en hSVEC og dyrke den under mekanisk stress et verdifullt verktøy for å forstå bidraget fra hSVEC dysfunksjon i venetransplantatsykdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

Koronar bypass graft (CABG) kirurgi er en prosedyre for å revaskularisere iskemisk myokard. Safenøs vene forblir brukt som en CABG-ledning til tross for redusert langsiktig patency sammenlignet med arterielle ledninger. Den brå økningen av hemodynamisk stress forbundet med transplantatarterien resulterer i vaskulær skade, spesielt endotelet, som kan påvirke den lave patenen til saphenøs venetransplantat (SVG). Her beskriver vi isolering, karakterisering og utvidelse av humane endotelceller i saphenøse vener (hSVEC). Celler isolert av kollagenasefordøyelse viser den typiske brosteinsmorfologien og uttrykker endotelcellemarkørene CD31 og VE-cadherin. For å vurdere den mekaniske spenningspåvirkningen ble protokoller brukt i denne studien for å undersøke de to viktigste fysiske stimuliene, skjærspenning og strekk, på arterialiserte SVGer. hSVEC dyrkes i et parallelt platestrømningskammer for å produsere skjærspenning, som viser justering i strømningsretningen og økt ekspresjon av KLF2, KLF4 og NOS3. hSVEC kan også dyrkes i en silisiummembran som tillater kontrollert cellulær strekk som etterligner venøs (lav) og arteriell (høy) strekk. Endotelcellenes F-aktinmønster og nitrogenoksid (NO) sekresjon moduleres tilsvarende av arteriell strekk. Oppsummert presenterer vi en detaljert metode for å isolere hSVEC for å studere påvirkningen av hemodynamisk mekanisk stress på en endotelial fenotype.

Vanligvis kan festede ECs observeres 3-4 dager etter ekstraksjon. hSVEC danner i utgangspunktet klynger av celler og viser en typisk "brosteinsmorfologi" (figur 1B). De uttrykker EC-markørene CD31 (figur 1C,D) og VE-cadherin (figur 1D). hSVEC kan lett forplantes på en ikke-belagt behandlet cellekulturskål, og de beholder endotelfenotypen i kultur opptil åtte passasjer.
hSVEC, når de ...

Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Vi beskriver en protokoll for å isolere og dyrke humane endotelceller i saphenøse vene (hSVECs). Vi tilbyr også detaljerte metoder for å produsere skjærspenning og strekk for å studere mekanisk belastning i hSVEC.

Isolering av endotelceller i humane safenøse vener og eksponering for kontrollerte nivåer av skjærspenning og strekk

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Den saphenøse venen blir plutselig utsatt for arterielle forhold etter koronar bypassoperasjon. Å forstå dens tilpasningsrespons på mekanisk stress kan bidra til å utforme terapeutiske verktøy for å forhindre venetransplantatsvikt. Denne endotelcelleisolasjonsprotokollen er veldig enkel og krever bare inkubasjon med kollagenase.Med minimal karmanipulasjon resulterer dette i redusert forurensning med glatte muskelceller og fibroblaster. Protokollen for å isolere humane SVEC og dyrke dem under skjærspenning og syklisk strekk er avgjørende for å forstå bidraget fra mekaniske krefter i endotelcelledysfunksjon assosiert med saphenøs venetransplantatsvikt. Tidligere endotelcellekultur er svært krevende når det gjelder cellemedietilskudd.Det er obligatorisk å legge til vekstfaktorer for å lykkes med å isolere en kultur, de menneskelige SVEC-ene. For å isolere primære humane endotelceller i saphenøse vener eller humane SVEC, samle minst et to- til tre centimeter langt saphenøst venesegment. Arbeid under en steril laminær strømningshette, overfør venesegmentet til en petriskål fylt med forvarmet PBS.For å fjerne alt blodet fra innsiden av lumen, sett inn en pipettespiss festet til en pipette og fylt med PBS i den ene enden av venen og skyll den forsiktig. Skyll den til vaskestrømmen blir helt klar. Lukk deretter den ene enden av venen med en steril bomullsutur.Fyll forsiktig beholderen med en milligram per milliliter kollagenase type 2-løsning og lukk den andre enden av karet med en bomullsutur. Inkuber beholderen med kollagenaseoppløsning i en fuktet atmosfære på 5% karbondioksid ved 37 grader celsius i en time. Deretter kutter du den ene enden av beholderen over et 15 milliliter rør for å samle kollagenaseoppløsningen før du kutter den andre enden.Skyll luminaloverflaten med en til to milliliter PBS for å samle alle de frittliggende endotelcellene inne i røret med kollagenase. Sentrifuger røret ved 400G i romtemperatur i fem minutter. Etter fjerning av supernatanten, suspenderes cellepelleten på nytt i tre til fire milliliter komplett endotelcellemedium som inneholder en ekstra heparinløsning.Plate cellene i en 60-millimeter cellekulturskål forhåndsbelagt med 3% vekt per volum gelatin. Inkuber cellene i en fuktet atmosfære i fire dager uten å endre mediet. Deretter bytter du mediet annenhver dag uten å legge til heparintilskuddet.Undersøk platen under mikroskopet for å sikre at de røde blodcellene ble fjernet. Etter en til fire dager etter ekstraksjon, avhengig av størrelsen og diameteren av venesegmentet, visualiser de humane SVECene ved fasekontrastmikroskopi for å evaluere graden av sammenløp og deres brosteinsmorfologi. Fortsett å endre media annenhver dag til cellene når 70% til 80% konfluens.Dekk strømningskammeret med 0,1 % vekt per volumgelatin og inkuber i minst 30 minutter ved 37 grader Celsius. For å balansere den fluidiske enheten og det sterile perfusjonssettet med 10 millimeter reservoarer, inkuber dem over natten i en fuktet atmosfære. For skjærspenningseksperimentet frø 200.000 endotelceller suspendert i 100 mikroliter kulturmedium inn i det gelatinbelagte strømningskammeret.For å feste cellene til kulturoverflaten, inkuber cellene i fire timer. Plasser perfusjonssettet på den fluidiske enheten. Fyll ut reservoarene og perfusjonssettet med ca. 12 milliliter forvarmet komplett endotelcellemedium.Fjern luftbobler fra perfusjonssettet for å balansere nivået på begge reservoarene ved fem milliliter. Plasser fluidenheten på det monterte perfusjonssettet uten kammerglid i inkubatoren og koble den elektriske kabelen til den datamaskinregulerte pumpen. Ved å kjøre den forhåndsdefinerte protokollen i pumpestyringsprogramvaren, fjernes alle luftbobler fra reservoarene og perfusjonssettet.Ta den fluidiske enheten med det monterte perfusjonssettet til den laminære strømningshetten og fest lysbildene med et monolag av konfluensceller. Etter å ha plassert hele enheten med lysbildene i inkubatoren, kobler du den elektriske kabelen til pumpen. I pumpestyringsprogramvaren justerer du oppsettet av fluidenheten ved å velge type lysbilde og stille inn viskositeten til mediet.I strømningsparametere angir du skjærspenningsverdien og angir syklusvarighet og strømningstype. Klikk deretter på avspillingsknappen for å starte eksperimentet. Husk å vedlikeholde lysbildet med celler behandlet med samme medium uten eksponering for strømning som statiske kontroller.Påfør silikonbasert smøremiddel på toppen og sidene av den 25 millimeter 6-brønns ekvibiaksiale lastestasjonen. Frø 400, 000 celler suspendert i tre milliliter til hver brønn av de 6-brønns fleksible bunnkulturplatene belagt med kollagen en. Inkuber cellene i fuktet luft til de når 100% konfluens.Før du starter strekkprotokollen, vask cellene en gang med forvarmet PBS og tilsett tre milliliter friskt kulturmedium per brønn. Sett inn bunnplaten med alle smurte lastestasjoner i inkubatoren og koble slangen på riktig måte med kontrollerutstyret til spenningscellens strekkende bioreaktorsystem. Fest hver kulturplate til en rød pakning levert av bioreaktorsystemet.Legg dem deretter inn i grunnplaten i inkubatoren. Plasser alle fire kulturplatene i bunnplaten for å oppnå riktig vakuum- og strekkbelastning. Slå på kontrollerutstyret og datasystemet.Åpne FlexCell-kontrollprogramvaren og konfigurer ønsket regime, inkludert prosentandel forlengelse, bølgeformform, frekvens og tid. Lagre regimet. Slå på vakuumsystemet, velg deretter diett og klikk start på dataskjermen for å kjøre strekkingen.Sjekk at silikonmembranen beveger seg og strekker cellene. De festede endotelcellene kunne observeres 4 til 10 dager etter ekstraksjonen. De danner i utgangspunktet celleklynger som viser en typisk brosteinsmorfologi.De uttrykte EC-markørene CD31 og VE-cadherin. HSVEC-ene når de dyrkes under skjærspenning justert i strømningsretningen. Skjærspenningen på 20 dyn per kvadratcentimeter i 72 timer induserer uttrykket av typiske mekanosensitive gener, KLF2, KLF4 og NOS3, noe som indikerer effektiviteten av skjærstimulansen.Det sykliske strekkutfallet var avhengig av intensiteten som ble brukt på de menneskelige SVEC-ene. Celler under lav strekk viste et kortikal F-aktinmønster som ligner statiske celler. Uten endring i nitrogenoksidutslipp i opptil 72 timer, remodellerte våre arterielle nivåer av strekk aktincytoskjelettet etter 24 timer og reduserte NO-frigjøring etter 72 timer.I tillegg til mekaniske stressstudier kan forskere bruke de isolerte cellene til å utføre ulike metoder for å utvide kunnskapen om endotelcellefunksjon og dysfunksjon. Etter den demonstrerte protokollen er det mulig å studere alle andre typer endotelceller under skjærspenning og strekk.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantasjon av en Carotid Cuff for Utløsende Shear-stress Induced Åreforkalkning i Mus

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-dimensjonale Resin Casting og bildebehandling av Mouse Portal Vein eller intrahepatiske kanalsystem

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Kontrollert Cervical Laserasjon Injury in Mus

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolasjon, Kultur, og Imaging of Human Fetal Bukspyttkjertelen Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

En Modifisert<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion analyse for å bestemme den potensielle rolle hormoner, Cytokiner og / eller vekstfaktorer i formidling Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Prosedyre for menneske saphena Veins<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusjons og ekstern forsterkning

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av human lymfatisk endotelceller ved Multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation and Culture Utvidelse av tumor-spesifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolasjon og Culture of Primary endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...