Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
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O JEK é apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 e 2013/17368-0] e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 e 309179/2013-0). A AAM é apoiada por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Segmentos não utilizados de veias safenas foram obtidos de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização miocárdica aortoventricular no Instituto do Coração (InCor) da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Todos os indivíduos deram consentimento informado para participar do estudo, que foi revisado e aprovado pelo comitê de ética local.
1. Isolamento, cultura e caracterização de células endoteliais primárias da veia safena humana (hSVECs)
<...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

O segmento da veia safena deve ter pelo menos 2 cm para isolar com sucesso as HCSV. Pequenos segmentos são difíceis de manusear e amarrar as extremidades do vaso para manter a solução de colagenase para isolar as células. A área luminal reduzida não produz células suficientes para expandir a cultura. Para minimizar o risco de contaminação com não-CE, a manipulação do segmento da veia safena precisa ser muito suave durante todo o procedimento. É importante ter cuidado ao introduzir as pontas da pipeta nas su...

A disfunção das células endoteliais (CE) é peça-chave na falência do enxerto de veia safena 1,2,3,4. O aumento sustentado do shear stress e do estiramento cíclico induz o fenótipo pró-inflamatório das células endoteliais da veia safena humana (hSVECs)3,4,5,6. As vias moleculares subjacentes ainda não são totalmente compreendidas, e protocolos padronizados para estudos in vitro podem alavancar os esforços para novos insights na área. Aqui, descrevemos um protocolo simples para isolar, caracterizar e expandir as HVECs e como expô-las a níveis variáveis de tensão de cisalhamento e estiramento cíclico, mimetizando as condições hemodinâmicas venosas e arteriais.
As hSVECs são isoladas por incubação da colagenase e podem ser utilizadas até a passagem 8. Esse protocolo requer menor manipulação do vaso em comparação com os outros protocolosdisponíveis7, o que reduz a contaminação com células musculares lisas e fibroblastos. Por outro lado, é necessário um segmento de vaso maior, de pelo menos 2 cm, para que a extração do CE seja eficiente. Na literatura, tem sido relatado que CEs de grandes vasos também podem ser obtidas por remoçãomecânica7,8. Embora eficaz, a abordagem física tem como desvantagens o baixo rendimento da CE e a maior contaminação por fibroblastos. Para aumentar a pureza, são necessários passos extras utilizando esferas magnéticas ou triagem celular, aumentando o custo do protocolo devido à aquisição de esferas e anticorpos 7,8. O método enzimático apresenta resultados mais rápidos e melhores quanto à pureza e viabilidade da CE 7,8.
As CE mais utilizadas para o estudo da disfunção endotelial são as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Sabe-se que o fenótipo da CE se altera nos diferentes leitos vasculares, sendo essencial o desenvolvimento de métodos que representem o vaso sobinvestigação9,10. Nesse sentido, o estabelecimento de um protocolo para isolar uma EVSS e cultivá-la sob estresse mecânico é uma ferramenta valiosa para entender a contribuição da disfunção da VExs na doença do enxerto venoso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

A cirurgia de revascularização miocárdica (CRM) é um procedimento para revascularizar o miocárdio isquêmico. A veia safena continua sendo utilizada como conduto de revascularização miocárdica, apesar da reduzida perviedade a longo prazo em relação aos condutos arteriais. O aumento abrupto do estresse hemodinâmico associado à arterialização do enxerto resulta em dano vascular, principalmente endotélio, que pode influenciar na baixa patência da ponte de veia safena (EVS). Descrevemos o isolamento, caracterização e expansão das células endoteliais da veia safena humana (HCSV). As células isoladas por digestão da colagenase exibem a morfologia típica do paralelepípedo e expressam marcadores de células endoteliais CD31 e VE-caderina. Para avaliar a influência das tensões mecânicas, protocolos foram utilizados neste estudo para investigar os dois principais estímulos físicos, tensão de cisalhamento e estiramento, em EVS arterializadas. As HVEs são cultivadas em uma câmara de fluxo de placa paralela para produzir tensão de cisalhamento, mostrando alinhamento na direção do fluxo e aumento da expressão de KLF2, KLF4 e NOS3. hSVECs também podem ser cultivados em uma membrana de silicone que permite o estiramento celular controlado mimetizando estiramento venoso (baixo) e arterial (alto). O padrão de F-actina das células endoteliais e a secreção de óxido nítrico (NO) são modulados de acordo com o estiramento arterial. Em resumo, apresentamos um método detalhado para isolar as HVECs para estudar a influência do estresse mecânico hemodinâmico em um fenótipo endotelial.

Normalmente, as CE aderidas podem ser observadas 3-4 dias após a extração. Os hSVECs inicialmente formam aglomerados de células e exibem uma morfologia típica de "paralelepípedos" (Figura 1B). Expressam os marcadores CE CD31 (Figura 1C,D) e VE-caderina (Figura 1D). Os hSVECs podem ser facilmente propagados em uma placa de cultura celular tratada não revestida e retêm o fenótipo endotelial em cultura até oi...

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Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Descrevemos um protocolo para isolar e cultivar células endoteliais da veia safena humana (hSVECs). Também fornecemos métodos detalhados para produzir tensão de cisalhamento e alongamento para estudar tensões mecânicas em hSVECs.

Isolamento de Células Endoteliais da Veia Samá Humana e Exposição a Níveis Controlados de Tensão de Cisalhamento e Estiramento

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

A veia safena é subitamente exposta a condições arteriais após cirurgia de revascularização miocárdica. A compreensão de sua resposta adaptativa ao estresse mecânico pode auxiliar no desenho de ferramentas terapêuticas para prevenir a falência do enxerto venoso. Este protocolo de isolamento de células endoteliais é muito simples e requer apenas incubação com colagenase.Com manipulação mínima do vaso, isso resulta em menor contaminação com células musculares lisas e fibroblastos. O protocolo para isolar as EVECs humanas e cultivá-las sob tensão de cisalhamento e estiramento cíclico é essencial para entender a contribuição das forças mecânicas na disfunção das células endoteliais associada à falência do enxerto de veia safena. A cultura prévia de células endoteliais é muito exigente em termos de suplementos de meios celulares.É obrigatório adicionar fatores de crescimento para isolar com sucesso uma cultura, os SVECs humanos. Para isolar células endoteliais primárias da veia safena humana ou EVECs humanas, coletar pelo menos um segmento de veia safena parva de dois a três centímetros de comprimento. Trabalhando sob uma capela de fluxo laminar estéril, transfira o segmento da veia para uma placa de Petri preenchida com PBS pré-aquecido.Para remover todo o sangue de dentro do lúmen, insira uma ponta de pipeta presa a uma pipeta e preenchida com PBS em uma extremidade da veia e lave-a suavemente. Lave-o até que o fluxo de lavagem fique completamente claro. Em seguida, feche uma extremidade da veia com uma sutura de algodão estéril.Preencha cuidadosamente o vaso com um miligrama por mililitro de solução de colagenase tipo 2 e feche a outra extremidade do vaso com uma sutura de algodão. Incubar o vaso com solução de colagenase numa atmosfera humidificada de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius durante uma hora. Em seguida, corte uma extremidade do vaso sobre um tubo de 15 mililitros para coletar a solução de colagenase antes de cortar a outra extremidade.Lavar a superfície luminal com um a dois mililitros de PBS para coletar todas as células endoteliais descoladas dentro do tubo com colagenase. Centrifugar o tubo a 400G em temperatura ambiente durante cinco minutos. Após a remoção do sobrenadante, ressuspenda o pellet de células em três a quatro mililitros de meio celular endotelial completo contendo uma solução adicional de heparina.Plaquear as células em uma placa de cultura celular de 60 milímetros pré-revestida com gelatina a 3% em peso por volume. Incubar as células em atmosfera umidificada por quatro dias sem alterar o meio. Depois disso, troque o meio a cada dois dias sem adicionar a suplementação de heparina.Examine a placa sob o microscópio para garantir que os glóbulos vermelhos foram removidos. Após um a quatro dias pós-extração, dependendo do tamanho e diâmetro do segmento venoso, visualizar as EVECs humanas por microscopia de contraste de fase para avaliar o grau de confluência e sua morfologia de paralelepípedos. Continue trocando a mídia a cada dois dias até que as células atinjam 70% a 80% de confluência.Revestir a lâmina da câmara de fluxo com gelatina a 0,1% do peso por volume e incubar por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius. Para equilibrar a unidade fluídica e o conjunto de perfusão estéril com reservatórios de 10 milímetros, incube-os durante a noite em uma atmosfera umedecida. Para o experimento de tensão de cisalhamento, semeou 200.000 células endoteliais suspensas em 100 microlitros de meio de cultura na lâmina da câmara de fluxo revestida com gelatina.Para fixar as células à superfície de cultura, incube as células por quatro horas. Coloque o conjunto de perfusão sobre a unidade fluídica. Preencher os reservatórios e o conjunto de perfusão com cerca de 12 mililitros de meio celular endotelial completo pré-aquecido.Remova as bolhas de ar do conjunto de perfusão para equilibrar o nível de ambos os reservatórios em cinco mililitros. Coloque a unidade fluídica no conjunto de perfusão montado sem a lâmina da câmara na incubadora e conecte seu cabo elétrico à bomba regulada por computador. Ao executar o protocolo pré-definido no software de controle da bomba, remova todas as bolhas de ar dos reservatórios e do conjunto de perfusão.Pegue a unidade fluídica com a perfusão montada ajustada para a capela de fluxo laminar e prenda as lâminas com uma monocamada de célula de confluência. Depois de colocar toda a unidade com as corrediças na incubadora, conecte seu cabo elétrico à bomba. No software de controle da bomba, ajuste a configuração da unidade fluídica selecionando o tipo de lâmina e ajustando a viscosidade do meio.Em parâmetros de fluxo, insira o valor da tensão de cisalhamento e defina a duração do ciclo e o tipo de fluxo. Em seguida, clique no botão de reprodução para iniciar o experimento. Lembre-se de manter a lâmina com células tratadas com o mesmo meio sem exposição ao fluxo como controles estáticos.Aplique lubrificante à base de silicone nas partes superiores e laterais da estação de carregamento equibiaxial de 6 poços de 25 milímetros. Semear 400.000 células suspensas em três mililitros para cada poço das placas de cultura de fundo flexível de 6 poços revestidas com colágeno. Incubar as células em ar umidificado até atingirem 100% de confluência.Antes de iniciar o protocolo de alongamento, lave as células uma vez com PBS pré-aquecido e adicione três mililitros de meio de cultura fresco por poço. Insira a placa de base com todas as estações de carregamento lubrificadas na incubadora e conecte adequadamente a tubulação com o equipamento controlador do sistema de biorreator de estiramento de células de tensão. Fixe cada placa de cultura a uma junta vermelha fornecida pelo sistema do biorreator.Em seguida, coloque-os na placa de base na incubadora. Coloque todas as quatro placas de cultura na placa de base para obter vácuo e carga de alongamento adequados. Ligue o equipamento controlador e o sistema do computador.Abra o software de controle FlexCell e configure o regime desejado, incluindo a porcentagem de alongamento, forma de onda, frequência e tempo. Salve o regime. Ligue o sistema de vácuo, selecione o regime e clique em iniciar na tela do computador para executar o alongamento.Verifique se a membrana de silicone está se movendo e esticando as células. As células endoteliais aderidas puderam ser observadas 4 a 10 dias após a extração. Inicialmente, formam aglomerados celulares exibindo uma morfologia típica de paralelepípedos.Expressaram os marcadores EC CD31 e VE-caderina. As hSVECs, quando cultivadas sob tensão de cisalhamento, alinharam-se na direção do fluxo. A tensão de cisalhamento de 20 dinas por centímetro quadrado durante 72 horas induz a expressão de genes mecanossensíveis típicos, KLF2, KLF4 e NOS3, indicando a eficácia do estímulo ao cisalhamento.O resultado do estiramento cíclico dependeu da intensidade aplicada às EVECs humanas. Células sob baixo estiramento mostraram um padrão de F-actina cortical semelhante às células estáticas. Sem alteração na liberação de óxido nítrico por até 72 horas, nossos níveis arteriais de estiramento remodelaram o citoesqueleto da actina após 24 horas e diminuíram a liberação de NO após 72 horas.Além dos estudos de estresse mecânico, os pesquisadores podem usar as células isoladas para realizar vários métodos para expandir o conhecimento da função e disfunção das células endoteliais. Seguindo o protocolo demonstrado, é possível estudar qualquer outro tipo de células endoteliais sob tensão de cisalhamento e estiramento.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Medicina

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantação de um Cuff Carotid para Triggering Shear-estresse aterosclerose induzida em camundongos

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-Dimensional Fundição de resina e Imagem da Veia Rato Portal ou Sistema intra-hepática Duto Biliar

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Controlada por laceração do colo do útero em camundongos

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A modificação<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Ensaio para determinar o possível papel dos hormônios, citocinas e / ou fatores de crescimento na Cancer Mediating Invasion celular

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedimento para safenas humanas Veias<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão e reforço externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolamento e cultura de células endoteliais primárias de Artérias e Veias canina

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...