Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

JEK поддерживается грантами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 и 2013/17368-0] и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 и 309179/2013-0). AAM поддерживается грантами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) и Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Неиспользованные сегменты подкожных вен были получены от пациентов, перенесших операцию аортокоронарного шунтирования в Институте сердца (InCor) Медицинской школы Университета Сан-Паулу. Все лица дали информированное согласие на участие в исследовании, которое было рассмотрено и одобр...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

Сегмент подкожной вены должен быть не менее 2 см для успешной изоляции hSVEC. Небольшие сегменты трудно обрабатывать и связывать концы сосуда для поддержания раствора коллагеназы для изоляции клеток. Уменьшенная площадь поверхности просвета не дает достаточного количества клеток для ра...

Дисфункция эндотелиальных клеток (ЭК) является ключевым фактором в недостаточности трансплантата подкожной вены 1,2,3,4. Устойчивое увеличение напряжения сдвига и циклического растяжения индуцирует провоспалительный фенотип эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVECs)3,4,5,6. Основные молекулярные пути до сих пор не полностью поняты, и стандартизированные протоколы для исследований in vitro могут использовать усилия для новых идей в этой области. Здесь мы описываем простой протокол для выделения, характеристики и расширения hSVEC и то, как подвергать их различным уровням напряжения сдвига и циклического растяжения, имитируя венозные и артериальные гемодинамические состояния.
hSVEC выделяются путем инкубации коллагеназы и могут использоваться до пассажа 8. Этот протокол требует меньшего количества манипуляций с сосудом по сравнению с другими доступными протоколами7, что снижает загрязнение гладкомышечными клетками и фибробластами. С другой стороны, для эффективного извлечения ЕС требуется больший сегмент сосуда не менее 2 см. В литературе сообщалось, что ЭК из крупных сосудов также могут быть получены путем механического удаления 7,8. Несмотря на эффективность, физический подход имеет недостатки, заключающиеся в низком выходе EC и более высокой контаминации фибробластов. Для повышения чистоты необходимы дополнительные шаги с использованием магнитных шариков или сортировки клеток, что увеличивает стоимость протокола из-за приобретения шариков и антител 7,8. Ферментативный метод дает более быстрые и лучшие результаты в отношении чистоты и жизнеспособности ЕС 7,8.
Наиболее часто используемыми ЭК для изучения эндотелиальной дисфункции являются эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Известно, что фенотип ЭК изменяется в разных сосудистых руслах, и необходимо разработать методы, представляющие исследуемый сосуд 9,10. В этом отношении создание протокола для выделения hSVEC и культивирования его в условиях механического стресса является ценным инструментом для понимания вклада дисфункции hSVEC в заболевание венозного трансплантата.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

Аортокоронарное шунтирование (АКШ) - это процедура реваскуляризации ишемического миокарда. Подкожная вена по-прежнему используется в качестве канала АКШ, несмотря на сниженную долгосрочную проходимость по сравнению с артериальными каналами. Резкое увеличение гемодинамического напряжения, связанного с артериализацией трансплантата, приводит к повреждению сосудов, особенно эндотелия, что может влиять на низкую проходимость трансплантата подкожной вены (SVG). Здесь мы описываем выделение, характеристику и расширение эндотелиальных клеток подкожных вен человека (hSVEC). Клетки, выделенные с помощью коллагеназного расщепления, демонстрируют типичную морфологию булыжника и экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток CD31 и VE-кадгерин. Чтобы оценить влияние механического напряжения, в этом исследовании были использованы протоколы для исследования двух основных физических стимулов, напряжения сдвига и растяжения, на артериализированных SVG. hSVEC культивируют в проточной камере с параллельной пластиной для создания напряжения сдвига, демонстрируя выравнивание в направлении потока и повышенную экспрессию KLF2, KLF4 и NOS3. hSVEC также можно культивировать в кремниевой мембране, которая позволяет контролировать клеточное растяжение, имитирующее венозное (низкое) и артериальное (высокое) растяжение. F-актиновый паттерн эндотелиальных клеток и секреция оксида азота (NO) модулируются соответственно артериальным растяжением. Таким образом, мы представляем подробный метод выделения hSVEC для изучения влияния гемодинамического механического стресса на фенотип эндотелия.

Как правило, прилипшие ЭК могут наблюдаться через 3-4 дня после экстракции. hSVEC первоначально образуют скопления клеток и демонстрируют типичную морфологию «булыжника» (рис. 1B). Они экспрессируют ЕС-маркеры CD31 (рис. 1C, D) и VE-кадгерин (рис. 1D).<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Мы описываем протокол выделения и культивирования эндотелиальных клеток подкожной вены человека (hSVECs). Мы также предлагаем подробные методы получения напряжения сдвига и растяжения для изучения механического напряжения в hSVEC.

Изоляция эндотелиальных клеток подкожных вен человека и воздействие контролируемых уровней напряжения сдвига и растяжения

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Подкожная вена внезапно подвергается артериальным заболеваниям после операции аортокоронарного шунтирования. Понимание его адаптационной реакции на механический стресс может помочь в разработке терапевтических инструментов для предотвращения отторжения венозного трансплантата. Этот протокол выделения эндотелиальных клеток очень прост и требует только инкубации с коллагеназой.При минимальных манипуляциях с сосудами это приводит к уменьшению загрязнения гладкомышечными клетками и фибробластами. Протокол выделения SVEC человека и их культивирования в условиях напряжения сдвига и циклического растяжения имеет важное значение для понимания вклада механических сил в дисфункцию эндотелиальных клеток, связанную с недостаточностью трансплантата подкожной вены. Предшествующая культура эндотелиальных клеток очень требовательна к добавкам клеточных сред.Обязательно добавление факторов роста, чтобы успешно изолировать культуру, человеческие SVEC. Для выделения первичных эндотелиальных клеток подкожной вены человека или SVEC человека собирают сегмент подкожной вены длиной не менее двух-трех сантиметров. Работая под стерильным вытяжным шкафом с ламинарным потоком, перенесите сегмент вены в чашку Петри, наполненную предварительно разогретым PBS.Чтобы удалить всю кровь изнутри просвета, вставьте наконечник пипетки, прикрепленный к пипетке и заполненный PBS, в один конец вены и осторожно промойте его. Промывайте его до тех пор, пока поток стирки не станет полностью прозрачным. Затем закройте один конец вены стерильным ватным швом.Осторожно заполните сосуд раствором коллагеназы 2-го типа из расчета один миллиграмм на миллилитр и закройте другой конец сосуда ватным швом. Инкубируйте сосуд с раствором коллагеназы в увлажненной атмосфере 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем отрежьте один конец сосуда над 15-миллилитровой трубкой, чтобы собрать раствор коллагеназы, прежде чем отрезать другой конец.Промойте поверхность просвета одним-двумя миллилитрами PBS, чтобы собрать все отделившиеся эндотелиальные клетки внутри трубки с помощью коллагеназы. Центрифугируйте пробирку при 400 г при комнатной температуре в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендировать клеточную гранулу в трех-четырех миллилитрах полной эндотелиальной клеточной среды, содержащей дополнительный раствор гепарина.Поместите клетки в 60-миллиметровую чашку для культивирования клеток, предварительно покрытую желатином 3% по объему. Инкубируют клетки в увлажненной атмосфере в течение четырех дней, не меняя среду. После этого меняйте среду через день, не добавляя добавки гепарина.Исследуйте пластину под микроскопом, чтобы убедиться, что эритроциты были удалены. Через один-четыре дня после экстракции, в зависимости от размера и диаметра сегмента вены, визуализируйте SVEC человека с помощью фазово-контрастной микроскопии, чтобы оценить степень слияния и морфологию их булыжника. Продолжайте менять среду каждые два дня, пока ячейки не достигнут слияния от 70% до 80%.Покройте предметное стекло проточной камеры желатином 0,1% веса на объем и выдерживайте не менее 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы уравновесить жидкостный блок и стерильный перфузионный набор, имеющий 10-миллиметровые резервуары, инкубируйте их в течение ночи в увлажненной атмосфере. Для эксперимента с напряжением сдвига 200 000 эндотелиальных клеток, взвешенных в 100 микролитрах питательной среды, помещают в предметное стекло проточной камеры, покрытое желатином.Чтобы прикрепить клетки к поверхности культуры, инкубируйте клетки в течение четырех часов. Поместите перфузионный набор на жидкостный блок. Заполните резервуары и перфузионный набор примерно 12 миллилитрами предварительно подогретой полной среды эндотелиальных клеток.Удалите пузырьки воздуха из перфузионного набора, чтобы уравновесить уровень обоих резервуаров на уровне пяти миллилитров. Поместите жидкостный блок на установленный перфузионный комплект без затвора камеры в инкубаторе и подключите его электрический кабель к насосу с компьютерным управлением. Запустив предварительно заданный протокол в программном обеспечении управления насосом, удалите все пузырьки воздуха из резервуаров и перфузионной установки.Возьмите жидкостный блок с установленным перфузионным устройством на колпаке с ламинарным потоком и прикрепите предметные стекла с монослоем ячейки слияния. Поместив весь блок с горками в инкубатор, подсоедините его электрический кабель к насосу. В программном обеспечении управления насосом отрегулируйте настройку жидкостного агрегата, выбрав тип суппорта и установив вязкость среды.В параметрах потока введите значение напряжения сдвига и установите продолжительность цикла и тип потока. Затем нажмите кнопку воспроизведения, чтобы начать эксперимент. Не забывайте поддерживать слайд с ячейками, обработанными той же средой, без воздействия потока, что и статические элементы управления.Нанесите смазку на основе силикона на верхнюю и боковые стороны 25-миллиметровой 6-луночной равноосной загрузочной станции. Засейте 400 000 клеток, взвешенных в трех миллилитрах, к каждой лунке из 6-луночных культуральных пластин с гибким дном, покрытых коллагеновой. Инкубируйте клетки в увлажненном воздухе до тех пор, пока они не достигнут 100% слияния.Перед началом протокола растяжки промойте клетки один раз предварительно подогретым PBS и добавьте по три миллилитра свежей питательной среды на лунку. Вставьте опорную плиту со всеми смазанными загрузочными станциями в инкубатор и соответствующим образом соедините трубку с управляющим оборудованием системы растяжения натяжных ячеек. Прикрепите каждую культуральную пластину к одной красной прокладке, предусмотренной системой биореактора.Затем поместите их в опорную пластину в инкубаторе. Поместите все четыре культуральные пластины в опорную плиту, чтобы добиться надлежащего вакуума и растягивающей нагрузки. Включите оборудование контроллера и компьютерную систему.Откройте управляющее программное обеспечение FlexCell и настройте желаемый режим, включая процент удлинения, форму волны, частоту и время. Сохраните схему. Включите вакуумную систему, затем выберите режим и нажмите «Пуск» на экране компьютера, чтобы запустить растяжку.Убедитесь, что силиконовая мембрана движется и растягивает клетки. Прилипшие эндотелиальные клетки можно было наблюдать через 4-10 дней после экстракции. Первоначально они образуют клеточные кластеры, демонстрирующие типичную морфологию булыжника.Они экспрессировали ЕС-маркеры CD31 и VE-кадгерин. hSVEC при культивировании под напряжением сдвига выравниваются по направлению потока. Напряжение сдвига 20 дин на квадратный сантиметр в течение 72 часов индуцирует экспрессию типичных механочувствительных генов KLF2, KLF4 и NOS3, что указывает на эффективность стимула сдвига.Результат циклического растяжения зависел от интенсивности, приложенной к человеческим SVEC. Клетки при низком растяжении показали корковый F-актиновый паттерн, похожий на статические клетки. Без изменения высвобождения оксида азота в течение 72 часов наши артериальные уровни растяжения ремоделировали актиновый цитоскелет через 24 часа и уменьшали высвобождение NO через 72 часа.Помимо исследований механического стресса, исследователи могут использовать изолированные клетки для выполнения различных методов для расширения знаний о функции и дисфункции эндотелиальных клеток. Следуя продемонстрированному протоколу, можно изучать любой другой тип эндотелиальных клеток при напряжении сдвига и растяжении.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Выделение мышью Респираторные эпителиальных клеток и воздействие экспериментальный сигаретный дым в воздухе жидкость

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Имплантация сонной манжеты для запуска Shear-стресс, вызванный атеросклероза у мышей

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-мерная литья смол и обработки изображений Мыши воротной вены или внутрипеченочных желчных протоков системы

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Контролируемые травма шейного Laceration у мышей

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Изоляция, культура и Визуализация человека плода поджелудочной кластеров клеток

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Модифицированный<em&gt; В пробирке</em&gt; Вторжение Пробирной для определения потенциальной роли гормонов, цитокинов и / или факторы роста в посредничестве клеточного рака Вторжение

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Порядок человека подкожных вен<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Перфузии и внешнего подкрепления

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Выделение человека эндотелиальных клеток лимфатической от нескольких параметров флуоресценции активирован сортировки клеток

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Выделение и культура Расширение опухоли конкретных эндотелиальных клеток

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...