Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
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JEK cuenta con el apoyo de donaciones de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 y 2013/17368-0] y del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 y 309179/2013-0). La AAM cuenta con el apoyo de donaciones de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) y del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Se obtuvieron segmentos no utilizados de venas safenas de pacientes sometidos a cirugía de bypass aortocoronario en el Instituto del Corazón (InCor), Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo. Todos los individuos dieron su consentimiento informado para participar en el estudio, que fue revisado y aprobado por el comité de ética local.
1. Aislamiento, cultivo y caracterización de células endoteliales primarias de venas safenas humanas (hSVECs)
<ol><li>Prepar...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

El segmento de la vena safena debe tener al menos 2 cm para aislar con éxito los hSVEC. Los segmentos pequeños son difíciles de manejar y atan los extremos del vaso para mantener la solución de colagenasa para aislar las células. La superficie luminal reducida no produce suficientes células para expandir el cultivo. Para minimizar el riesgo de contaminación con no CE, la manipulación del segmento de la vena safena debe ser muy suave durante todo el procedimiento. Es importante tener cuidado al introducir las punt...

La disfunción de las células endoteliales (CE) es un actor clave en el fracaso del injerto de vena safena 1,2,3,4. El aumento sostenido del esfuerzo cortante y el estiramiento cíclico induce el fenotipo proinflamatorio de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVECs)3,4,5,6. Las vías moleculares subyacentes aún no se comprenden completamente, y los protocolos estandarizados para estudios in vitro pueden aprovechar los esfuerzos para obtener nuevos conocimientos en el área. Aquí, describimos un protocolo simple para aislar, caracterizar y expandir los hSVEC y cómo exponerlos a niveles variables de esfuerzo cortante y estiramiento cíclico, imitando las condiciones hemodinámicas venosas y arteriales.
Los hSVEC se aíslan por incubación de colagenasa y se pueden utilizar hasta el paso 8. Este protocolo requiere menos manipulación del vaso en comparación con los otros protocolos disponibles7, lo que reduce la contaminación con células musculares lisas y fibroblastos. Por otro lado, requiere un segmento de recipiente más grande de al menos 2 cm para tener una extracción eficiente de la CE. En la literatura, se ha relatado que las CE de grandes vasos también pueden obtenerse por eliminación mecánica 7,8. Aunque eficaz, el enfoque físico tiene las desventajas de un bajo rendimiento de EC y una mayor contaminación por fibroblastos. Para aumentar la pureza, se necesitan pasos adicionales utilizando perlas magnéticas o clasificación celular, aumentando el costo del protocolo debido a la adquisición de perlas y anticuerpos 7,8. El método enzimático tiene resultados más rápidos y mejores en cuanto a la pureza y viabilidad de la CE 7,8.
Las CE más utilizadas para estudiar la disfunción endotelial son las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs). Se sabe que el fenotipo CE cambia en diferentes lechos vasculares, y es esencial desarrollar métodos que representen el vaso investigado 9,10. En este sentido, el establecimiento de un protocolo para aislar un hSVEC y cultivarlo bajo estrés mecánico es una herramienta valiosa para comprender la contribución de la disfunción hSVEC en la enfermedad del injerto venoso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

La cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG, por sus siglas en inglés) es un procedimiento para revascularizar el miocardio isquémico. La vena safena sigue siendo utilizada como conducto de la CABG a pesar de la reducción de la permeabilidad a largo plazo en comparación con los conductos arteriales. El aumento abrupto del estrés hemodinámico asociado con la arterialización del injerto resulta en daño vascular, especialmente el endotelio, que puede influir en la baja permeabilidad del injerto de vena safena (SVG). Aquí, describimos el aislamiento, caracterización y expansión de las células endoteliales de la vena safena humana (hSVEC). Las células aisladas por digestión de colagenasa muestran la morfología típica de adoquines y expresan marcadores celulares endoteliales CD31 y VE-cadherina. Para evaluar la influencia del estrés mecánico, se utilizaron protocolos en este estudio para investigar los dos estímulos físicos principales, el esfuerzo cortante y el estiramiento, en SVG arterializados. Los hSVEC se cultivan en una cámara de flujo de placa paralela para producir esfuerzo cortante, mostrando alineación en la dirección del flujo y mayor expresión de KLF2, KLF4 y NOS3. Los hSVEC también se pueden cultivar en una membrana de silicio que permite un estiramiento celular controlado que imita el estiramiento venoso (bajo) y arterial (alto). El patrón de actina F de las células endoteliales y la secreción de óxido nítrico (NO) se modulan en consecuencia por el estiramiento arterial. En resumen, presentamos un método detallado para aislar hSVECs para estudiar la influencia del estrés mecánico hemodinámico en un fenotipo endotelial.

Por lo general, los CE adheridos se pueden observar 3-4 días después de la extracción. Los hSVEC inicialmente forman grupos de células y muestran una morfología típica de "adoquines" (Figura 1B). Expresan los marcadores CE CD31 (Figura 1C,D) y VE-cadherina (Figura 1D). Los hSVEC se pueden propagar fácilmente en una placa de cultivo celular tratado no recubierto, y conservan el fenotipo endotelial en cultivo h...

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Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Describimos un protocolo para aislar y cultivar células endoteliales de venas safenas humanas (hSVECs). También proporcionamos métodos detallados para producir esfuerzo cortante y estiramiento para estudiar el estrés mecánico en hSVEC.

Aislamiento de células endoteliales de venas safenas humanas y exposición a niveles controlados de esfuerzo cortante y estiramiento

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

La vena safena se expone repentinamente a afecciones arteriales después de la cirugía de derivación de la arteria coronaria. Comprender su respuesta de adaptación al estrés mecánico puede ayudar a diseñar herramientas terapéuticas para prevenir el fracaso del injerto venoso. Este protocolo de aislamiento de células endoteliales es muy sencillo y sólo requiere incubación con colagenasa.Con una manipulación mínima de los vasos, esto reduce la contaminación con células musculares lisas y fibroblastos. El protocolo para aislar los SVEC humanos y cultivarlos bajo esfuerzo cortante y estiramiento cíclico es esencial para comprender la contribución de las fuerzas mecánicas en la disfunción de las células endoteliales asociadas con el fracaso del injerto de vena safena. El cultivo celular endotelial previo es muy exigente en términos de suplementos de medios celulares.Es obligatorio agregar factores de crecimiento para aislar con éxito un cultivo, los SVEC humanos. Para aislar células endoteliales primarias de la vena safena humana o SVEC humanas, recolecte al menos un segmento de vena safena de dos a tres centímetros de largo. Trabajando bajo una campana de flujo laminar estéril, transfiera el segmento de la vena a una placa de Petri llena de PBS precalentado.Para eliminar toda la sangre del interior de la luz, inserte una punta de pipeta unida a una pipeta y llénela con PBS en un extremo de la vena y enjuáguela suavemente. Enjuague hasta que el flujo de lavado se aclare por completo. Luego cierre un extremo de la vena con una sutura de algodón estéril.Llene cuidadosamente el vaso con un miligramo por mililitro de solución de colagenasa tipo 2 y cierre el otro extremo del recipiente con una sutura de algodón. Incubar el recipiente con solución de colagenasa en una atmósfera humidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora. Luego corte un extremo del recipiente sobre un tubo de 15 mililitros para recolectar la solución de colagenasa antes de cortar el otro extremo.Enjuague la superficie luminal con uno o dos mililitros de PBS para recoger todas las células endoteliales desprendidas dentro del tubo con colagenasa. Centrifugar el tubo a 400 g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en tres o cuatro mililitros de medio celular endotelial completo que contenga una solución adicional de heparina.Coloque las células en una placa de cultivo celular de 60 milímetros pre-recubierta con 3% de peso por volumen de gelatina. Incubar las células en una atmósfera humidificada durante cuatro días sin cambiar el medio. Después de eso, cambie el medio cada dos días sin agregar la suplementación con heparina.Examine la placa bajo el microscopio para asegurarse de que se hayan eliminado los glóbulos rojos. Después de uno a cuatro días después de la extracción, dependiendo del tamaño y diámetro del segmento de la vena, visualice los SVEC humanos mediante microscopía de contraste de fase para evaluar el grado de confluencia y su morfología de adoquines. Continúe cambiando los medios cada dos días hasta que las células alcancen el 70% al 80% de confluencia.Cubra el portaobjetos de la cámara de flujo con 0,1% de peso por volumen de gelatina e incube durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados. Para equilibrar la unidad fluídica y el conjunto de perfusión estéril que tiene depósitos de 10 milímetros, incubarlos durante la noche en una atmósfera humidificada. Para el experimento de esfuerzo cortante, sembrar 200, 000 células endoteliales suspendidas en 100 microlitros de medio de cultivo en el portaobjetos de la cámara de flujo recubierta de gelatina.Para unir las células a la superficie de cultivo, incubar las células durante cuatro horas. Coloque el conjunto de perfusión en la unidad fluídica. Llene los depósitos y el conjunto de perfusión con aproximadamente 12 mililitros de medio celular endotelial completo precalentado.Retire las burbujas de aire del conjunto de perfusión para equilibrar el nivel de ambos depósitos a cinco mililitros. Coloque la unidad fluídica en el equipo de perfusión montado sin la corredera de la cámara en la incubadora y conecte su cable eléctrico a la bomba regulada por computadora. Al ejecutar el protocolo predefinido en el software de control de la bomba, elimine todas las burbujas de aire de los depósitos y del conjunto de perfusión.Tome la unidad fluídica con el conjunto de perfusión montado en la campana de flujo laminar y fije los portaobjetos que tienen una monocapa de celda de confluencia. Después de colocar toda la unidad con las guías en la incubadora, conecte su cable eléctrico a la bomba. En el software de control de la bomba, ajuste la configuración de la unidad fluídica seleccionando el tipo de portaobjetos y ajustando la viscosidad del medio.En los parámetros de flujo, introduzca el valor de esfuerzo cortante y establezca la duración del ciclo y el tipo de flujo. A continuación, haga clic en el botón de reproducción para iniciar el experimento. Recuerde mantener el portaobjetos con células tratadas con el mismo medio sin exposición al flujo como controles estáticos.Aplique lubricante a base de silicona en la parte superior y lateral de la estación de carga equibiaxial de 25 milímetros y 6 pocillos. Semilla 400, 000 células suspendidas en tres mililitros a cada pocillo de las placas de cultivo de fondo flexible de 6 pocillos recubiertas con colágeno uno. Incubar las células en aire humidificado hasta que alcancen el 100% de confluencia.Antes de comenzar el protocolo de estiramiento, lave las células una vez con PBS precalentado y agregue tres mililitros de medio de cultivo fresco por pocillo. Inserte la placa base con todas las estaciones de carga lubricadas en la incubadora y conecte adecuadamente el tubo con el equipo controlador del sistema de biorreactor de estiramiento de células de tensión. Fije cada placa de cultivo a una junta roja proporcionada por el sistema de biorreactor.Luego colóquelos en la placa base en la incubadora. Coloque las cuatro placas de cultivo en la placa base para lograr una carga de vacío y estiramiento adecuada. Encienda el equipo controlador y el sistema informático.Abra el software de control FlexCell y configure el régimen deseado, incluido el porcentaje de elongación, la forma de onda, la frecuencia y el tiempo. Guarde el régimen. Encienda el sistema de vacío, luego seleccione el régimen y haga clic en iniciar en la pantalla de la computadora para ejecutar el estiramiento.Compruebe que la membrana de silicona se está moviendo y estirando las células. Las células endoteliales adheridas se podían observar de 4 a 10 días después de la extracción. Inicialmente forman grupos de células que muestran una morfología típica de adoquines.Expresaron los marcadores CE CD31 y VE-cadherina. Los hSVEC cuando se cultivan bajo tensión de cizallamiento se alinean en la dirección del flujo. El esfuerzo cortante de 20 dinas por centímetro cuadrado durante 72 horas induce la expresión de genes mecanosensibles típicos, KLF2, KLF4 y NOS3, lo que indica la efectividad del estímulo de cizallamiento.El resultado del estiramiento cíclico dependió de la intensidad aplicada a los SVEC humanos. Las células bajo bajo estiramiento mostraron un patrón cortical de actina F similar a las células estáticas. Sin cambios en la liberación de óxido nítrico durante un máximo de 72 horas, nuestros niveles arteriales de estiramiento remodelaron el citoesqueleto de actina después de 24 horas y disminuyeron la liberación de NO después de 72 horas.Además de los estudios de estrés mecánico, los investigadores pueden usar las células aisladas para realizar varios métodos para ampliar el conocimiento de la función y disfunción de las células endoteliales. Siguiendo el protocolo demostrado, es posible estudiar cualquier otro tipo de células endoteliales bajo esfuerzo cortante y estiramiento.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Aislamiento de ratón las células epiteliales respiratorias y la exposición al humo del cigarrillo Experimental de la interfaz de aire líquido

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Investigación

Medicina

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantación de un manguito de la carótida para provocar esfuerzo cortante aterosclerosis inducida en ratones

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-Dimensional resina de moldeo e Imagen de la vena portal del ratón o Sistema vías biliares intrahepáticas

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Controlado lesiones laceración cervical en ratones

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

El aislamiento, la cultura, y de imágenes de Human Fetal pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Un Modificado<em&gt; In vitro</em&gt; Invasión Ensayo para determinar el papel potencial de hormonas, citoquinas y / o factores de crecimiento en la invasión de células del cáncer de Mediación

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedimiento para safena humana Venas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión y refuerzo externo

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Aislamiento de células endoteliales linfático humano por Multi-parámetro de clasificación de células activadas por fluorescencia

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias de las arterias y venas caninas

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...