Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

JEK stöds av bidrag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 och 2013/17368-0] och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 och 309179/2013-0). AAM stöds av bidrag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).

Oanvända segment av saphenösa vener erhölls från patienter som genomgick aortokoronar bypassoperation vid Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Alla individer gav informerat samtycke till att delta i studien, som granskades och godkändes av den lokala etiska kommittén.
1. Isolering, odling och karakterisering av primära humana saphenösa venendotelceller (hSVEC)
<ol><li>Förberedelse<ol><li>Autoklav ett par raka eller krökta pincett och v?...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

Det saphenösa vensegmentet bör ha varit minst 2 cm för att framgångsrikt isolera hSVEC. Små segment är svåra att hantera och binda ändarna av kärlet för att bibehålla kollagenaslösningen för att isolera cellerna. Den reducerade luminala ytan ger inte tillräckligt med celler för att expandera kulturen. För att minimera risken för kontaminering med icke-ECs måste manipuleringen av det saphenösa vensegmentet vara mycket försiktig under hela proceduren. Det är viktigt att vara försiktig när pipettspets...

Endotelcell (EC) dysfunktion är en nyckelspelare i saphenous ven transplantat misslyckande 1,2,3,4. Den ihållande ökningen av skjuvspänning och cyklisk stretch inducerar den proinflammatoriska fenotypen av humana saphenösa venendotelceller (hSVEC)3,4,5,6. De underliggande molekylära vägarna är fortfarande inte helt förstådda, och standardiserade protokoll för in vitro-studier kan utnyttja ansträngningarna för nya insikter inom området. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att isolera, karakterisera och expandera hSVEC och hur man utsätter dem för varierande nivåer av skjuvspänning och cyklisk sträckning, vilket efterliknar de venösa och arteriella hemodynamiska tillstånden.
hSVEC isoleras genom kollagenasinkubation och kan användas fram till passage 8. Detta protokoll kräver mindre manipulation av kärlet jämfört med de andra tillgängliga protokollen7, vilket minskar kontaminering med glattmuskelceller och fibroblaster. Å andra sidan krävs det ett större kärlsegment på minst 2 cm för att ha effektiv EC-extraktion. I litteraturen har det rapporterats att EC från stora fartyg också kan erhållas genom mekaniskt avlägsnande 7,8. Även om det fysiska tillvägagångssättet är effektivt har det nackdelar som låg EC-avkastning och högre fibroblastkontaminering. För att öka renheten behövs extra steg med magnetiska pärlor eller cellsortering, vilket ökar kostnaden för protokollet på grund av förvärv av pärlor och antikroppar 7,8. Den enzymatiska metoden ger snabbare och bättre resultat avseende EC renhet och livskraft 7,8.
De vanligaste EC: erna för att studera endoteldysfunktion är humana navelvenendotelceller (HUVEC). Det är känt att EG-fenotypen förändras i olika kärlbäddar, och det är viktigt att utveckla metoder som representerar det kärl som undersöks 9,10. I detta avseende är upprättandet av ett protokoll för att isolera en hSVEC och odla den under mekanisk belastning ett värdefullt verktyg för att förstå bidraget från hSVEC-dysfunktion vid ventransplantatsjukdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

Koronar bypass-transplantation (CABG) kirurgi är ett förfarande för att revaskularisera ischemiskt myokardium. Saphenös ven används fortfarande som en CABG-ledning trots den minskade långsiktiga patencyen jämfört med arteriella ledningar. Den plötsliga ökningen av hemodynamisk stress i samband med transplantatarterialiseringen resulterar i vaskulär skada, särskilt endotelet, som kan påverka den låga patencyen hos saphenous ventransplantat (SVG). Här beskriver vi isolering, karakterisering och expansion av humana saphenösa venendotelceller (hSVEC). Celler isolerade genom kollagenassmältning visar den typiska kullerstensmorfologin och uttrycker endotelcellmarkörer CD31 och VE-cadherin. För att bedöma den mekaniska stresspåverkan användes protokoll i denna studie för att undersöka de två huvudsakliga fysiska stimuli, skjuvspänning och sträckning, på arterialiserade SVG. hSVEC odlas i en parallell plattflödeskammare för att producera skjuvspänning, vilket visar inriktning i flödesriktningen och ökat uttryck av KLF2, KLF4 och NOS3. hSVEC kan också odlas i ett kiselmembran som möjliggör kontrollerad cellulär stretch, efterliknar venös (låg) och arteriell (hög) stretch. Endotelcellernas F-aktinmönster och kväveoxid (NO) utsöndring moduleras följaktligen av arteriell sträcka. Sammanfattningsvis presenterar vi en detaljerad metod för att isolera hSVEC för att studera påverkan av hemodynamisk mekanisk stress på en endotelfenotyp.

Vanligtvis kan vidhäftade ECs observeras 3-4 dagar efter extraktion. hSVEC bildar initialt kluster av celler och uppvisar en typisk "kullerstensmorfologi" (figur 1B). De uttrycker EG-markörerna CD31 (figur 1C,D) och VE-cadherin (figur 1D). hSVEC kan enkelt förökas på en icke-belagd behandlad cellodlingsskål, och de behåller endotelfenotypen i odling upp till åtta passager.
hSVEC, ...

Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

Vi beskriver ett protokoll för att isolera och odla humana saphenösa venendotelceller (hSVEC). Vi tillhandahåller också detaljerade metoder för att producera skjuvspänning och stretch för att studera mekanisk spänning i hSVEC.

Isolering av humana endotelceller i saphenös ven och exponering för kontrollerade nivåer av skjuvspänning och sträckning

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Den saphenösa venen utsätts plötsligt för arteriella tillstånd efter kranskärlskirurgi. Att förstå dess anpassningsrespons på mekanisk stress kan hjälpa till att utforma terapeutiska verktyg för att förhindra ventransplantatfel. Detta endotelcellsisoleringsprotokoll är mycket enkelt och kräver endast inkubation med kollagenas.Med minimal kärlmanipulation resulterar detta i minskad kontaminering med glattmuskelceller och fibroblaster. Protokollet för att isolera humana SVEC och odla dem under skjuvspänning och cyklisk stretch är avgörande för att förstå bidraget från mekaniska krafter vid endotelcellsdysfunktion associerad med saphenös ventransplantatfel. Tidigare endotelcellodling är mycket krävande när det gäller cellmediatillskott.Det är obligatoriskt att lägga till tillväxtfaktorer för att framgångsrikt isolera en kultur, de mänskliga SVEC. För att isolera primära humana saphenösa venendotelceller eller humana SVEC, samla minst ett två till tre centimeter långt saphenöst vensegment. Arbeta under en steril laminär flödeshuv, överför vensegmentet till en petriskål fylld med förvärmd PBS.För att ta bort allt blod från insidan av lumen, sätt in en pipettspets fäst vid en pipett och fylld med PBS i ena änden av venen och spola den försiktigt. Spola det tills tvättflödet blir helt klart. Stäng sedan ena änden av venen med en steril bomullssutur.Fyll försiktigt kärlet med en milligram per milliliter kollagenas typ 2-lösning och stäng den andra änden av kärlet med en bomullssutur. Inkubera kärlet med kollagenaslösning i en fuktad atmosfär av 5% koldioxid vid 37 grader Celsius i en timme. Skär sedan ena änden av kärlet över ett 15-milliliter rör för att samla kollagenaslösningen innan du skär den andra änden.Spola luminalytan med en till två milliliter PBS för att samla alla fristående endotelceller inuti röret med kollagenas. Centrifugera röret vid 400 G i rumstemperatur i fem minuter. Efter avlägsnande av supernatanten, suspendera cellpelleten igen i tre till fyra milliliter fullständigt endotelcellmedium innehållande en ytterligare heparinlösning.Platta cellerna i en 60-millimeters cellodlingsskål förbelagd med 3% vikt per volym gelatin. Inkubera cellerna i en fuktad atmosfär i fyra dagar utan att byta medium. Därefter byter du medium varannan dag utan att lägga till heparintillskottet.Undersök plattan under mikroskopet för att säkerställa att de röda blodkropparna avlägsnades. Efter en till fyra dagar efter extraktion, beroende på vensegmentets storlek och diameter, visualisera de humana SVEC: erna genom faskontrastmikroskopi för att utvärdera graden av sammanflöde och deras kullerstensmorfologi. Fortsätt att byta media varannan dag tills cellerna når 70% till 80% sammanflöde.Belägg flödeskammarens glas med 0,1% vikt per volym gelatin och inkubera i minst 30 minuter vid 37 grader Celsius. För att balansera den fluidiska enheten och den sterila perfusionssatsen med 10 millimeter reservoarer, inkubera dem över natten i en fuktad atmosfär. För skjuvspänningsexperimentet suspenderade frö 200 000 endotelceller i 100 mikroliter odlingsmedium i den gelatinbelagda flödeskammaren.För att fästa cellerna på odlingsytan, inkubera cellerna i fyra timmar. Placera perfusionsuppsättningen på fluidenheten. Fyll i behållarna och perfusionsuppsättningen med cirka 12 ml förvärmt komplett endotelcellmedium.Ta bort luftbubblor från perfusionsuppsättningen för att balansera nivån på båda behållarna vid fem milliliter. Placera fluidenheten på det monterade perfusionssetet utan kammarglid i inkubatorn och anslut dess elektriska kabel till den datorreglerade pumpen. Genom att köra det fördefinierade protokollet i pumpstyrningsprogramvaran ska alla luftbubblor avlägsnas från behållarna och perfusionssetet.Ta fluidenheten med den monterade perfusionssatsen till den laminära flödeshuven och fäst objektglasen med ett monolager av sammanflödesceller. När du har placerat hela enheten med glidbanorna i inkubatorn, anslut den elektriska kabeln till pumpen. I pumpstyrningsprogramvaran justerar du inställningen av fluidenheten genom att välja typ av glas och ställa in mediets viskositet.I flödesparametrar anger du skjuvspänningsvärdet och ställer in cykelns varaktighet och flödestyp. Klicka sedan på uppspelningsknappen för att starta experimentet. Kom ihåg att underhålla objektglaset med celler behandlade med samma media utan exponering för flöde som statiska kontroller.Applicera silikonbaserat smörjmedel på toppen och sidorna av 25-millimeter 6-brunns ekvibiaxial laddningsstation. Frö 400 000 celler suspenderade i tre milliliter till varje brunn av de 6-brunniga flexibla bottenodlingsplattorna belagda med kollagen en. Inkubera cellerna i fuktad luft tills de når 100% sammanflöde.Innan stretchprotokollet påbörjas, tvätta cellerna en gång med förvärmd PBS och tillsätt tre milliliter färskt odlingsmedium per brunn. Sätt in basplattan med alla smorda laddningsstationer i inkubatorn och anslut slangen på lämpligt sätt med styrutrustningen för spänningscellsträckningsbioreaktorsystemet. Fäst varje odlingsplatta på en röd packning som tillhandahålls av bioreaktorsystemet.Lägg dem sedan i basplattan i inkubatorn. Placera alla fyra odlingsplattorna i bottenplattan för att uppnå korrekt vakuum och sträckbelastning. Slå på styrenheten och datorsystemet.Öppna FlexCell-kontrollprogramvaran och konfigurera önskad regim inklusive procentuell töjning, vågform, frekvens och tid. Spara regimen. Slå på vakuumsystemet, välj sedan regimen och klicka på start på datorskärmen för att köra sträckningen.Kontrollera att silikonmembranet rör sig och sträcker cellerna. De vidhäftade endotelcellerna kunde observeras 4 till 10 dagar efter extraktionen. De bildar initialt cellkluster som visar en typisk kullerstensmorfologi.De uttryckte EG-markörerna CD31 och VE-cadherin. hSVEC: erna när de odlas under skjuvspänning justeras i flödesriktningen. Skjuvspänningen på 20 dyner per kvadratcentimeter i 72 timmar inducerar uttrycket av typiska mekanokänsliga gener, KLF2, KLF4 och NOS3, vilket indikerar skjuvstimulansens effektivitet.Det cykliska stretchutfallet berodde på intensiteten som applicerades på humana SVEC. Celler under låg sträckning visade ett kortikalt F-aktinmönster som liknar statiska celler. Utan förändring i kväveoxidfrisättningen i upp till 72 timmar ombyggde våra arteriella nivåer av stretch aktincytoskelettet efter 24 timmar och minskade NO-frisättningen efter 72 timmar.Förutom mekaniska stressstudier kan forskare använda de isolerade cellerna för att utföra olika metoder för att utöka kunskapen om endotelcellsfunktion och dysfunktion. Efter det demonstrerade protokollet är det möjligt att studera någon annan typ av endotelceller under skjuvspänning och sträckning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Isolering av Mouse Respiratory epitelceller och exponering för experimentell cigarettrök på Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantation av en Carotid Manschett för att utlösa Sear-stress åderförkalkning hos möss

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-dimensionell hartsgjutdel och avbildning av mus portvenen eller Intrahepatisk Bile Duct System

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Kontrollerad Cervikal Laceration Skada hos möss

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolering, kultur, och avbildning av Human Fetal Pankreas cell kluster

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

En modifierad<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion analys för att fastställa den potentiella roll Hormoner, cytokiner och / eller tillväxtfaktorer vid medie Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Förfarande för mänskliga vena Vener<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusion och extern Förstärkning

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av Human Lymphatic endotelceller från Multi-parameter fluorescensaktiverad cellsortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolering och odling Expansion av Tumörspecifika endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolering och odling av primära endotelceller från Canine artärer och vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...