Name: human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

JEK, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ve 2013/17368-0] ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ve 309179/2013-0) hibeleriyle desteklenmektedir. AAM, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9) hibeleriyle desteklenmektedir.

Safen venlerin kullanılmayan segmentleri, São Paulo Üniversitesi Tıp Fakültesi Kalp Enstitüsü'nde (InCor) aortokoroner bypass ameliyatı geçiren hastalardan elde edildi. Tüm bireyler, yerel etik kurul tarafından gözden geçirilen ve onaylanan çalışmaya katılmak için bilgilendirilmiş onam vermiştir.
1. Primer insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu
<ol><li>Hazırlık<ol><li>Bir çift düz veya kavisli fors...

<ol>
	<li>Allaire, E., Clowes, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+injury+in+cardiovascular+surgery:+the+intimal+hyperplastic+response.">Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).</li><li>Ali, M. H., Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+responses+to+mechanical+stress:+where+is+the+mechanosensor.">Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor.</a> Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).</li><li>Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+inflammation+of+the+venous+endothelium+in+vein+graft+disease.">Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease.</a> Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).</li><li>Ward, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-&#954;B+inhibition+prevents+acute+shear+stress-induced+inflammation+in+the+saphenous+vein+graft+endothelium.">NF-&#954;B inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15133 (2020).</li><li>Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumferential+deformation+and+shear+stress+induce+differential+responses+in+saphenous+vein+endothelium+exposed+to+arterial+flow.">Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).</li><li>Gir&#227;o-Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+stretch+induces+endothelial+dysfunction+accompanied+by+oxidative+stress+and+actin+remodeling+in+human+saphenous+vein+endothelial+cells.">High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13493 (2021).</li><li>Ataollahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+the+isolation+of+endothelial+cells+from+large+vessels.">New method for the isolation of endothelial cells from large vessels.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).</li><li>Torres, C., Machado, R., Lima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+characterization+of+the+saphenous+veins+endothelial+cells+in+patients+with+chronic+venous+disease+and+in+patients+undergoing+bypass+surgery:+an+exploratory+study.">Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study.</a> Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+II.+Representative+vascular+beds.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds.</a> Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).</li><li>Jambusaria, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+heterogeneity+across+distinct+vascular+beds+during+homeostasis+and+inflammation.">Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation.</a> eLife. 9, e51413 (2020).</li><li>Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-arrestin+is+critical+for+early+shear+stress-induced+Akt/eNOS+activation+in+human+vascular+endothelial+cells.">&#946;-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).</li><li>Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+regulates+endothelial+nitric+oxide+synthase+expression+through+c-Src+by+divergent+signaling+pathways.">Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways.</a> Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).</li><li>Dekker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+fluid+shear+stress+induces+a+distinct+set+of+endothelial+cell+genes,+most+specifically+lung+Kruppel-like+factor+(KLF2).">Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2).</a> Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).</li><li>Hamik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kruppel-like+factor+4+regulates+endothelial+inflammation.">Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).</li><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype:+implications+for+vascular+tissue+engineering.">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).</li></ol>

hSVEC'leri başarılı bir şekilde izole etmek için safen ven segmenti en az 2 cm olmalıdır. Küçük segmentlerin, hücreleri izole etmek için kollajenaz çözeltisini korumak için damarın uçlarını tutması ve bağlaması zordur. Azaltılmış luminal yüzey alanı, kültürü genişletmek için yeterli hücre vermez. ECs olmayanlarla kontaminasyon riskini en aza indirmek için, safen ven segmentinin manipülasyonu tüm prosedür boyunca çok nazik olmalıdır. Kanı çıkarmak için pipet uçlarını luminal ...

Endotel hücre (EC) disfonksiyonu safen ven greft yetmezliğinde anahtar rol oynar1,2,3,4. Kayma stresinin ve siklik gerilmenin sürekli artışı, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) proinflamatuar fenotipini indükler3,4,5,6. Altta yatan moleküler yollar hala tam olarak anlaşılamamıştır ve in vitro çalışmalar için standartlaştırılmış protokoller, bölgedeki yeni anlayışlar için çabalardan yararlanabilir. Burada, hSVEC'leri izole etmek, karakterize etmek ve genişletmek için basit bir protokolü ve bunların venöz ve arteriyel hemodinamik koşulları taklit ederek değişken seviyelerde kayma stresi ve siklik gerilmeye nasıl maruz bırakılacağını açıklıyoruz.
hSVEC'ler kollajenaz inkübasyonu ile izole edilir ve 8. pasaja kadar kullanılabilir. Bu protokol, mevcut diğer protokollere kıyasla damarın daha az manipülasyonunu gerektirir7, bu da düz kas hücreleri ve fibroblastlarla kontaminasyonu azaltır. Öte yandan, verimli EC ekstraksiyonuna sahip olmak için en az 2 cm'lik daha büyük bir kap segmenti gerektirir. Literatürde, büyük damarlardan alınan ECs'lerin mekanik uzaklaştırma ile de elde edilebileceği bildirilmiştir 7,8. Etkili olmasına rağmen, fiziksel yaklaşım düşük EC verimi ve daha yüksek fibroblast kontaminasyonu gibi dezavantajlara sahiptir. Saflığı arttırmak için, manyetik boncuklar veya hücre sıralama kullanarak ekstra adımlara ihtiyaç vardır, bu da boncukların ve antikorların elde edilmesi nedeniyle protokolün maliyetini arttırır7,8. Enzimatik yöntem, EC saflığı ve canlılığı ile ilgili daha hızlı ve daha iyi sonuçlara sahiptir 7,8.
Endotel disfonksiyonunu incelemek için en sık kullanılan EC'ler insan umbilikal ven endotel hücreleridir (HUVEC'ler). EC fenotipinin farklı damar yataklarında değiştiği bilinmektedir ve incelenen damarı temsil eden yöntemlerin geliştirilmesi esastır 9,10. Bu bakımdan, bir hSVEC'in izole edilmesi ve mekanik stres altında kültürlenmesi için bir protokol oluşturulması, ven grefti hastalığında hSVEC disfonksiyonunun katkısını anlamak için değerli bir araçtır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 &#181; slide I 0.4 Luer&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells equibiaxial loading station of 25 mm&#160;</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>LS-3000B25.VJW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slide with removable well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid (Glacial)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet 1 cm thick</td>
			<td>Plexiglass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31, FITC antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MHCD3101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-cadherin antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioflex plates collagen I</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>BF3001C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm</td>
			<td>Brasuture</td>
			<td>AP524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophilin reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 basal medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 SingleQuots supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC4176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2657-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexcell FX-5000 tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td>FX-5000T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>SKU 68027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF2 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KLF4 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOA 280 nitric oxide analyzer</td>
			<td>Sievers Instruments</td>
			<td>NOA-280i-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 forward primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOS3 reverse primer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin - Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanTitec SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K flex platform&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4471087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy micro kit&#160;</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (24 mm x 60 mm)</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td>VD12460Y1D.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV first-strand synthesis system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18091200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human saphenous vein endothelial cell isolation and exposure to controlled levels of shear stress and stretch

Koroner arter baypas greft (KABG) cerrahisi iskemik miyokardın revaskülarize edilmesi için yapılan bir prosedürdür. Safen ven, arteriyel kanallara kıyasla azalmış uzun süreli açıklığa rağmen CABG kanalı olarak kullanılmaya devam etmektedir. Greft arteriyelizasyonu ile ilişkili hemodinamik stresin ani artışı, safen ven greftinin (SVG) düşük açıklığını etkileyebilecek vasküler hasara, özellikle de endotelle sonuçlanır. Burada, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) izolasyonu, karakterizasyonu ve genişlemesi anlatılmaktadır. Kollajenaz sindirimi ile izole edilen hücreler tipik parke taşı morfolojisini gösterir ve endotel hücre belirteçleri CD31 ve VE-kadherini eksprese eder. Mekanik stres etkisini değerlendirmek için, bu çalışmada, arteriyalize SVG'ler üzerindeki iki ana fiziksel uyaranı, kayma stresini ve gerilmeyi araştırmak için protokoller kullanılmıştır. hSVEC'ler, kayma gerilmesi üretmek için paralel bir plaka akış odasında kültürlenir, akış yönünde hizalama ve KLF2, KLF4 ve NOS3'ün artan ekspresyonunu gösterir. hSVEC'ler ayrıca venöz (düşük) ve arteriyel (yüksek) gerilmeyi taklit eden kontrollü hücresel gerilmeye izin veren bir silikon membranda kültürlenebilir. Endotel hücrelerinin F-aktin paterni ve nitrik oksit (NO) sekresyonu buna göre arteriyel gerilme ile modüle edilir. Özetle, hemodinamik mekanik stresin endotel fenotipi üzerindeki etkisini incelemek için hSVEC'leri izole etmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Tipik olarak, yapışmış EC'ler ekstraksiyondan 3-4 gün sonra gözlenebilir. hSVEC'ler başlangıçta hücre kümeleri oluşturur ve tipik bir "parke taşı" morfolojisi gösterir (Şekil 1B). EC belirteçleri CD31 (Şekil 1C,D) ve VE-kadherini (Şekil 1D) ifade ederler. hSVEC'ler, kaplanmamış tedavi edilmiş bir hücre kültürü kabında kolayca çoğaltılabilir ve kültürdeki endotel fenotipini sekiz pasaj...

Watch this Scientific Journal Video about Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch at JoVE.com

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

Safen ven, koroner arter bypass ameliyatı sonrası aniden arteriyel rahatsızlıklara maruz kalır. Mekanik strese adaptasyon tepkisini anlamak, ven grefti yetmezliğini önlemek için terapötik araçların tasarlanmasına yardımcı olabilir. Bu endotel hücre izolasyon protokolü çok basittir ve sadece kollajenaz ile inkübasyon gerektirir.Minimal damar manipülasyonu ile bu, düz kas hücreleri ve fibroblastlarla kontaminasyonun azalmasına neden olur. İnsan SVEC'lerinin izole edilmesi ve kayma stresi ve siklik gerilme altında kültürlenmesi protokolü, safen ven greft yetmezliği ile ilişkili endotel hücre disfonksiyonunda mekanik kuvvetlerin katkısını anlamak için gereklidir. Önceki endotel hücre kültürü, hücre ortamı takviyeleri açısından çok zordur.Bir kültürü, insan SVEC'lerini başarılı bir şekilde izole etmek için büyüme faktörleri eklemek zorunludur. Primer insan safen ven endotel hücrelerini veya insan SVEC'lerini izole etmek için, en az iki ila üç santimetre uzunluğunda safen ven segmenti toplayın. Steril bir laminer akış başlığı altında çalışarak, damar segmentini önceden ısıtılmış PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.Tüm kanı lümenin içinden çıkarmak için, bir pipete tutturulmuş ve PBS ile doldurulmuş bir pipet ucunu damarın bir ucuna yerleştirin ve yavaşça yıkayın. Yıkama akışı tamamen netleşene kadar yıkayın. Daha sonra damarın bir ucunu steril bir pamuk sütü ile kapatın.Kabı mililitre kollajenaz tip 2 çözeltisi başına bir miligram ile dikkatlice doldurun ve kabın diğer ucunu bir pamuk sütü ile kapatın. Kabı kollajenaz çözeltisi ile bir saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Ardından, diğer ucunu kesmeden önce kollajenaz çözeltisini toplamak için kabın bir ucunu 15 mililitrelik bir tüp üzerinde kesin.Tüpün içindeki tüm ayrılmış endotel hücrelerini kollajenaz ile toplamak için luminal yüzeyi bir ila iki mililitre PBS ile yıkayın. Tüpü oda sıcaklığında 400G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini ek bir heparin çözeltisi içeren üç ila dört mililitre tam endotel hücre ortamında tekrar askıya alın.Hücreleri, hacim başına %3 jelatin ağırlığı ile önceden kaplanmış 60 milimetrelik bir hücre kültürü kabında kaplayın. Hücreleri, ortamı değiştirmeden dört gün boyunca nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Bundan sonra, heparin takviyesi eklemeden ortamı her gün değiştirin.Kırmızı kan hücrelerinin çıkarıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında inceleyin. Ekstraksiyondan bir ila dört gün sonra, damar segmentinin boyutuna ve çapına bağlı olarak, insan SVEC'lerini faz kontrast mikroskobu ile görselleştirerek birleşme derecesini ve parke taşı morfolojisini değerlendirin. Hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaşana kadar her iki günde bir ortamı değiştirmeye devam edin.Akış odası sürgüsünü hacim başına %0,1 ağırlıkla kaplayın jelatin ve 37 santigrat derecede en az 30 dakika inkübe edin. Akışkan üniteyi ve 10 milimetrelik rezervuarlara sahip steril perfüzyon setini dengelemek için, bunları bir gecede nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Kesme gerilme deneyi için, tohum 200.000 endotel hücresi, jelatin kaplı akış odası slaytına 100 mikrolitre kültür ortamında askıya alınmıştır.Hücreleri kültür yüzeyine bağlamak için, hücreleri dört saat boyunca inkübe edin. Perfüzyon setini akışkan üniteye yerleştirin. Rezervuarları ve perfüzyon setini yaklaşık 12 mililitre önceden ısıtılmış tam endotel hücresi ortamı ile doldurun.Her iki rezervuarın seviyesini beş mililitrede dengelemek için perfüzyon setinden hava kabarcıklarını çıkarın. Akışkan üniteyi, inkübatördeki oda sürgüsü olmadan monte edilmiş perfüzyon setine yerleştirin ve elektrik kablosunu bilgisayar tarafından düzenlenen pompaya bağlayın. Pompa kontrol yazılımında önceden tanımlanmış protokolü çalıştırarak, rezervuarlardaki ve perfüzyon setindeki tüm hava kabarcıklarını çıkarın.Akışkan üniteyi, laminer akış başlığına monte edilmiş perfüzyon seti ile alın ve bir birleşme hücresi tek katmanına sahip kızakları takın. Tüm üniteyi inkübatördeki slaytlarla yerleştirdikten sonra, elektrik kablosunu pompaya bağlayın. Pompa kontrol yazılımında, kızak tipini seçerek ve ortamın viskozitesini ayarlayarak akışkan ünitesi kurulumunu ayarlayın.Akış parametrelerinde, kayma gerilimi değerini girin ve döngü süresini ve akış tipini ayarlayın. Ardından, denemeyi başlatmak için oynat düğmesini tıklayın. Slaytı, statik denetimler olarak akışa maruz kalmadan aynı ortamla muamele edilmiş hücrelerle tutmayı unutmayın.25 milimetrelik 6 delikli eşeksenli yükleme istasyonunun üst kısımlarına ve yanlarına silikon bazlı yağlayıcı uygulayın. Tohum 400.000 hücre, kollajen ile kaplanmış 6 kuyucuklu esnek tabanlı kültür plakalarının her bir kuyucuğuna üç mililitre halinde askıya alınmıştır. Hücreleri% 100 akıcılığa ulaşana kadar nemlendirilmiş havada inkübe edin.Germe protokolüne başlamadan önce, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın ve kuyucuk başına üç mililitre taze kültür ortamı ekleyin. Taban plakasını inkübatördeki tüm yağlanmış yükleme istasyonlarıyla birlikte yerleştirin ve boruyu gerilim hücresi germe biyoreaktör sisteminin kontrolör ekipmanına uygun şekilde bağlayın. Her kültür plakasını biyoreaktör sistemi tarafından sağlanan bir kırmızı contaya takın.Sonra onları inkübatördeki taban plakasına koyun. Uygun vakum ve germe yükü elde etmek için dört kültür plakasını da taban plakasına yerleştirin. Oyun kumandası ekipmanını ve bilgisayar sistemini açın.FlexCell kontrol yazılımını açın ve uzama yüzdesi, dalga formu şekli, frekans ve zaman dahil olmak üzere istenen rejimi yapılandırın. Rejimi kurtarın. Vakum sistemini açın, ardından rejimi seçin ve germe işlemini çalıştırmak için bilgisayar ekranında başlat'ı tıklayın.Silikon membranın hareket ettiğini ve hücreleri gerdiğini kontrol edin. Yapıştırılan endotel hücreleri, ekstraksiyondan 4 ila 10 gün sonra gözlemlenebilir. Başlangıçta tipik bir parke taşı morfolojisi gösteren hücre kümeleri oluştururlar.EC belirteçleri CD31 ve VE-kadherini ifade ettiler. Kesme gerilmesi altında kültürlendiğinde hSVEC'ler akış yönünde hizalanır. 72 saat boyunca santimetrekare başına 20 dinin kayma gerilmesi, kesme uyaranının etkinliğini gösteren tipik mekanosensitif genlerin, KLF2, KLF4 ve NOS3'ün ekspresyonunu indükler.Döngüsel gerilme sonucu, insan SVEC'lerine uygulanan yoğunluğa bağlıydı. Düşük gerilme altındaki hücreler, statik hücrelere benzer kortikal bir F-aktin paterni gösterdi. Nitrik oksit salınımında 72 saate kadar bir değişiklik olmadan, arteriyel gerilme seviyelerimiz 24 saat sonra aktin hücre iskeletini yeniden şekillendirdi ve 72 saat sonra NO salınımını azalttı.Mekanik stres çalışmalarının yanı sıra, araştırmacılar izole edilmiş hücreleri endotel hücre fonksiyonu ve disfonksiyonu hakkındaki bilgileri genişletmek için çeşitli yöntemler uygulamak için kullanabilirler. Gösterilen protokolü takiben, kesme stresi ve gerilme altında başka herhangi bir endotel hücresi türünü incelemek mümkündür.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Hava Sıvı Arabirimi Fare Solunum Epitel Hücreleri ve Deneysel sigara dumanına maruz kalma izolasyonu

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Fare Shear stres İndüklenmiş Ateroskleroz Tetikleme Karotis Kol İmplantasyonu

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-Boyutlu Reçine Döküm ve Fare Portal Ven veya intrahepatik safra Sisteminin Görüntüleme

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Farelerde Kontrollü Servikal yırtığı Sakatlık

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Bir Modifiye<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

İnsan Safen Ven Prosedürü<em&gt; Ex vivo</em&gt; Perfüzyon ve Dış Takviye

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...