Name: standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00
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Nous tenons à remercier la FIOCRUZ (« Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA »), le Programme de troisième cycle en biotechnologie (PPGBIOTEC de l’Universidade Federal do Amazonas - UFAM), la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) et la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pour l’octroi des bourses. La figure 2 et la figure 4 ont été créées avec biorender.com.

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.
1. Extraction des IgY à partir des jaunes d’œufs
<ol><li>Hygiénisation des oeufs<ol><li>Plongez les œufs (fraîchement pondus ou jusqu’à 4 jours après la ponte, de la lignée Gallus gallus Dekalb White) dans une solution diluée à 0,2 % d’hypochlorite de sodium, rincez rapidement à l’eau coura...

<ol>
	<li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies.">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).</li><li>de Figueiredo, A. M., Gl&#243;ria, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mari&#250;ba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry:+A+review.">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+bead-based+multiplexing.">The genesis and evolution of bead-based multiplexing.</a> Methods. 158, 2-11 (2019).</li><li>Kellar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microsphere-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays.</a> Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).</li><li>Schade, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+A+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins+in+the+control+of+terrestrial+and+aquatic+animal+diseases:+A+review.">Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review.</a> Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments.">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).</li><li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li><li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk.">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).</li><li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents.">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li><li>Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgY+Technology:+Extraction+of+chicken+antibodies+from+egg+yolk+by+polyethylene+glycol+(PEG)+precipitation.">IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).</li><li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides.">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li><li>Ko, K. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+immunoglobulin+Y+from+egg+yolk+using+ammonium+sulfate+precipitation+and+ion+exchange+chromatography.">Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.</a> Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+IgY+from+the+yolks+of+eggs+by+a+chloroform+polyethylene+glycol+procedure.">Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure.</a> Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).</li><li>Simonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xMAP-based+analysis+of+three+most+prevalent+staphylococcal+toxins+in+Staphylococcus+aureus+cultures.">xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+for+detection+of+staphylococcal+and+streptococcal+exotoxins.">A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins.</a> PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).</li><li>Merbah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+a+cytometric+p24-capture+bead-assay+for+the+detection+of+main+HIV-subtypes.">Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes.</a> Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).</li></ol>

La méthode de précipitation des anticorps IgY par réduction du pH suivie d’une séparation des lipides à l’aide d’acide caprylique est efficace pour isoler les anticorps totaux sans aucune perte de fonctionnalité. La méthode proposée ici est plus simple et moins coûteuse que celle rapportée par Redwan et al.11, qui utilisaient également la précipitation par acidification et l’acide caprylique mais avec un protocole plus complexe et laborieux. Cette méthode présente également ...

Parmi les techniques d’immunodosage visant à diagnostiquer les maladies, le dosage cytométrique sur billes s’est imposé comme une approche très sensible et fiable, puisqu’il permet d’analyser des milliers de particules en un seul test1. Cette technique, en plus d’avoir une productivité élevée et de permettre l’utilisation de plus petits volumes d’échantillons, présente également une grande flexibilité, car elle permet la détection de plusieurs molécules, telles que les cytokines, les molécules d’adhésion, les isotypes d’anticorps et les protéines 2,3.
Différentes particules sont utilisées pour le développement de ces dosages, parmi lesquelles des billes de latex, qui constituent un intrant efficace et peu coûteux. Celles-ci peuvent présenter des modifications à leur surface, comme la présence de groupes fonctionnels ou de protéines qui permettent le couplage covalent ou non covalent de certaines molécules 3,4,5.
Ces immunoessais utilisent des composants tels que des antigènes et des anticorps pour détecter les marqueurs de la maladie et nécessitent généralement des anticorps provenant de mammifères tels que les souris, les lapins et les chèvres. Cela crée des problèmes liés à des questions éthiques, car l’immunisation des mammifères nécessite généralement de nombreux animaux pour obtenir un bon rendement, ainsi que l’exécution fréquente de procédures qui conduisent à la souffrance des animaux 6,7. Une alternative à cela est l’utilisation d’anticorps IgY isolés à partir des jaunes d’œufs de poulets immunisés, car des concentrations élevées d’anticorps spécifiques contre les antigènes inoculés peuvent être trouvées dans les jaunes ; La production d’un poulet équivaut à la production de 4,3 lapins au cours d’une année 6,7.
Ainsi, l’objectif de ce protocole est de fournir une méthode d’évaluation des anticorps IgY obtenus à partir de jaunes d’œufs de poule par cytométrie en flux avec des billes de latex. Pour cela, nous proposons une méthode de standardisation d’un immunodosage cytométrique sur billes en format sandwich à l’aide de billes de latex. Comme modèle, nous avons utilisé des anticorps IgY dirigés contre l’antigène de la protéine II riche en histidine de Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2). Nous décrivons une méthode d’extraction des anticorps, discutons des étapes critiques pour définir la concentration de couplage de ceux-ci aux billes de latex, et présentons une évaluation de la limite de détection de l’antigène. La haute précision de la cytométrie en flux, associée au faible coût des billes de latex, rend cette technique applicable à l’analyse des outils d’immunoessai, tels que les anticorps et les antigènes. Cette méthode peut être utilisée pour la détection de diverses cibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF&#160;488A antibody produced in donkey</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#8242;)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BF-FACSC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T research beads (CS&#38;T research beads)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software 7.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloride 37% acid molecular grade</td>
			<td>NEON</td>
			<td>02618 NEON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML latex, 4% w/v</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-HM8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003335620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>P.10.0594.024.00.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>R09211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer Heat/Cool</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K80-120R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies

Les immunoessais sont des tests importants pour la détection de nombreuses cibles moléculaires. Parmi les méthodes actuellement disponibles, le dosage cytométrique sur billes a pris de l’importance au cours des dernières décennies. Chaque microsphère lue par l’équipement représente un événement d’analyse de la capacité d’interaction entre les molécules testées. Des milliers de ces événements sont lus en un seul essai, ce qui garantit une précision et une reproductibilité élevées du test. Cette méthodologie peut également être utilisée dans la validation de nouveaux intrants, tels que les anticorps IgY, pour le diagnostic de maladies. Ces anticorps sont obtenus en immunisant les poulets avec l’antigène d’intérêt, puis en extrayant l’immunoglobuline du jaune des œufs des animaux ; Par conséquent, il s’agit d’une méthode indolore et très productive pour obtenir les anticorps. En plus d’une méthodologie de validation de haute précision de la capacité de reconnaissance d’anticorps de ce test, cet article présente également une méthode d’extraction de ces anticorps, de détermination des meilleures conditions de couplage pour les anticorps et les billes de latex, et de détermination de la sensibilité du test.

La figure 2 fournit une représentation graphique du processus d’extraction des anticorps IgY par acidification, suivie d’une séparation à l’aide d’acide caprylique (figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> Figure 2 : Représentation schématique de l’étape d’extraction des ant...

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Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

Ce protocole décrit une méthodologie pour la préparation de billes de latex pour des tests utilisant des anticorps IgY pour la détection d’antigènes.

Standardisation d’un dosage cytométrique sur billes à base d’anticorps jaunes d’œuf

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

Parmi les techniques d’immunodosage visant à diagnostiquer les maladies, le test cytométrique sur billes s’est imposé comme une approche très sensible et fiable, analysant des milliers de particules en un seul essai. La haute précision de la cytométrie en flux, associée au faible coût des billes de latex, rend notre technique applicable à l’analyse des outils d’immunoessais, tels que les anticorps et les antigènes. Les anticorps IgY ont un faible coût, et les avantages éthiques dans leur production, et peuvent être utilisés comme outil de détection de maladies rares.Commencez par immerger les œufs fraîchement pondus ou âgés de quatre jours, de la lignée Gallus gallus deckle white, dans une solution diluée à 0,2 % d’hypochlorite de sodium. Rincez-les rapidement à l’eau courante et essuyez-les délicatement. Cassez soigneusement l’œuf, séparez le jaune du blanc à l’aide d’un séparateur de jaunes.Et retirez l’excédent de blanc avec du papier filtre. Percez le jaune d’œuf et récupérez son intérieur dans un tube conique de 50 millilitres. Conservez le jaune d’œuf à moins 20 degrés Celsius pendant au moins 24 heures avant de l’utiliser.Après avoir décongelé le jaune stocké, diluez-le dans un rapport de un à 10 dans un PBS millimolaire. Ajustez le pH de la solution à cinq, avec un acide chlorhydrique normal, et incubez la solution à quatre degrés Celsius pendant six à 24 heures. Centrifuger la solution à 3000 G pendant 40 minutes, et filtrer le surnageant récupéré à l’aide d’un filtre en cellulose de 0,7 millimètre, avant de réajuster le pH du surnageant à cinq.Ajouter l’acide caprylique jusqu’à une concentration finale de 8,7 % en remuant constamment, pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir centrifugé les échantillons pendant 15 minutes, séparez le surnageant du matériau précipité. Réajustez le pH de la solution à 7,4 à l’aide d’une molaire d’hydroxyde de sodium.Et quantifier les anticorps à l’aide du test de Bradford, avant de les stocker à moins 20 degrés Celsius. Ajoutez 21 microlitres d’EDC et 21 microlitres de NHS à 21 microlitres de billes de latex. Et ajustez à un volume final de 2,1 millilitres, avec du PBS filtré de 10 millimolaires.Incuber la solution à 22 degrés Celsius, en agitant rapidement, pendant trois heures. Ajouter l’anticorps de capture précédemment extrait, IgY PfHRP2, à différents microtubes contenant 100 microlitres de cette solution. Et incuber à nouveau pendant 16 heures.Après avoir centrifugé les échantillons et éliminé les surnageants, laver les billes de latex deux fois avec 500 microlitres de PBS filtré de 10 millimolaires, en utilisant des cycles de centrifugation et de remise en suspension. Pour le blocage des billes, remettez les échantillons en suspension dans un millilitre de tampon de blocage et suivez la même procédure que celle indiquée précédemment pour l’incuber pendant deux heures. Après avoir lavé les billes avec du PBS, remettez-les en suspension dans un tampon PBS de 10 millimolaires.Ajouter 100 microlitres d’anticorps fluorescents anti-poulet, dilués à un à 2000 dans un mélange de 10 millimolaires de PBS et de BSA, dans chaque microtube. Incubez les échantillons dans l’obscurité pendant 30 minutes. Après avoir lavé les billes, remettez-les en suspension avec 250 microlitres de PBS filtré de 10 millimolaires.Déterminer la limite de détection en distribuant 100 microlitres de la préparation de billes bloquées, dans des tubes contenant différentes quantités de la protéine recombinante diluée PfHRP2 en trois exemplaires. Incuber les solutions de billes avec la protéine à 22 degrés Celsius, en agitant rapidement, pendant une heure. Lavez les billes avec 500 microlitres de PBS filtré de 10 millimolaires, avec centrifugation, comme démontré précédemment.Après avoir éliminé le surnageant, ajoutez deux microgrammes d’anticorps IgG de souris contre la protéine recombinante, dilués dans 10 millimolaires de PBS et de BSA à chaque échantillon, et suivez la même procédure d’incubation. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’anticorps fluorescent dilué contre la souris à chaque échantillon. Après l’incubation, remettre l’échantillon en suspension dans 250 microlitres de PBS filtré de 10 millimolaires.Allumez l’ordinateur et le cytomètre en flux, puis attendez quelques minutes que l’équipement se connecte à l’ordinateur. Cliquez sur le logiciel de cytométrie installé sur l’ordinateur et connectez-vous. Dans l’espace de travail du logiciel, sélectionnez Cytomètre, suivi de Démarrage de la fluidique, Modes de nettoyage et Rinçage SIT.Définissez la stratégie de déclenchement en fonction des caractéristiques morphométriques et de fluorescence de la particule témoin négative. Pour déterminer la morphométrie des cellules, choisissez le graphique de tracé de points pour l’analyse des paramètres de diffusion vers l’avant A à l’aide de la diffusion latérale A.Déterminez les cellules individuelles par dispersion latérale à l’aide d’un graphique de tracé de points pour l’analyse de la dispersion latérale W sur l’axe Y et de la dispersion latérale H sur l’axe X. Et déterminez les cellules individuelles par diffusion vers l’avant, à l’aide d’un graphique de tracé à points, pour l’analyse de la diffusion vers l’avant W sur l’axe Y et de la diffusion vers l’avant H sur l’axe X.Pour l’analyse de fluorescence, choisissez des tracés à points FL1 à l’aide d’une diffusion vers l’avant A.Utilisez un tube en polystyrène bouché contenant des échantillons non marqués et des échantillons préalablement étiquetés avec Alexa Fluor 488 unicolore Et mélangez soigneusement le contenu du tube. Fixez le tube à la sonde du cytomètre en flux et cliquez avec le bouton gauche de la souris sur Acquérir. Pour régler la puissance des lasers, cliquez sur Paramètres, et dans les options ci-dessous, ajustez la tension de la diffusion directe à 182 volts et la tension de la diffusion latérale à 236 volts.Pour définir le seuil sur le cytomètre, cliquez sur Seuil, et dans les options ci-dessous, ajustez le FSC à 500 volts. Réglez la porte d’analyse pour caractériser les particules en fonction de leur taille et de leur complexité, ainsi que pour effectuer une analyse de cellule unique. Éliminez l’autofluorescence en analysant l’échantillon sans colorant contenant uniquement les billes de latex et en ajustant la tension du détecteur FL1 FITC à 332 volts.Définissez la porte d’analyse de fluorescence au format quadrangulaire, à partir du point négatif indiqué dans le graphique à points. Une fois les analyses morphométriques et fluorescentes ajustées, configurez l’appareil pour 50 000 événements et cliquez sur Enregistrer. Les profils électrophorétiques de l’anticorps IgY PfHRP2, dû à la séparation à l’aide de l’acide caprylique, sont présentés ici.Sur cette figure, on peut voir que les anticorps avant et après la séparation de l’acide caprylique présentaient des profils électrophorétiques similaires, avec des bandes caractéristiques de 65 kilodaltons et 27 kilodaltons, qui font référence aux chaînes légères et lourdes de l’IgY. En plus de ceux-ci, d’autres bandes sont également visibles, probablement en raison du précurseur de la vitellogénine II de la protéine du jaune d’œuf du fragment terminal C. L’évaluation de la concentration de saturation en anticorps sur les billes de latex est essentielle pour développer un test immunologique avec les billes.Une courbe du pourcentage de fluorescence de différentes concentrations d’anticorps, couplée à chaque microlitre de billes de latex commerciales utilisées, est présentée ici. Au fur et à mesure que la concentration augmentait, les valeurs en pourcentage augmentaient également et plafonnaient à deux microgrammes de concentration d’anticorps, ce qui en faisait la concentration de couplage optimale pour le test immunologique de l’antigène cible. La limite de détection a été déterminée en évaluant le pourcentage de fluorescence de la réactivité de la vitesse du latex par rapport à des concentrations variables de la protéine rPfHRP2.À partir d’un test immunologique sandwich, il a été observé que la fluorescence était passée de 0,01 microgramme de protéine PfHRP2 à un plateau de 0,1 microgramme. Il n’y avait pas de différence significative de fluorescence à zéro microgramme et 0,01 microgramme. Cependant, une différence significative de fluorescence a été observée à 0,01 microgramme, 0,1 microgramme et 10 microgrammes.L’étape de lavage de ce protocole est critique pour éviter la perte de billes. La jauge doit être bien définie afin qu’il n’y ait pas d’erreurs dans le résultat obtenu. Les étapes décrites ici représentent une standardisation importante, qui est nécessaire pour assurer la fiabilité des tests diagnostiques utilisant des billes de latex qui sont évaluées par cytométrie complète.Par conséquent, cette méthodologie est une alternative aux modèles de test sandwich classiques. Cette méthode peut être appliquée à divers types de dosages, et peut convenir pour faire face à plusieurs molécules à la surface des billes, ainsi que pour la détection de différents analytes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Un test basé sur la fluorescence de phospholipides scramblase Activité

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Recherche

Biochimie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

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Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolement des particules de lipoprotéine du jaune d'oeuf de poulet pour l'étude de l'incorporation d'acide gras de pathogène bactérien dans les phospholipides de membrane

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Interrogation parallèle du recrutement d'2-Arrestin2 pour le dépistage de Ligand sur une échelle GPCR-Wide utilisant PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Dépistage des phytoestrogènes à l’aide d’un récepteur d’œstrogènes à base β de Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Un essai à base d’électrochimie pour Les variantes de protéines MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Pinces optiques pour étudier les interactions ARN-protéine dans la régulation de la traduction

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Études des interactions chaperonne-cochapéroé à l’aide d’un essai homogène à base de billes

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...