Name: standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00
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Wir danken dem FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), dem Postgraduiertenprogramm in Biotechnologie (PPGBIOTEC an der Universidade Federal do Amazonas - UFAM), der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) und der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) für die Bereitstellung der Stipendien. Abbildung 2 und Abbildung 4 wurden mit biorender.com erstellt.

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Extraktion von IgY aus Eigelb
<ol><li>Hygienisierung der Eier<ol><li>Tauchen Sie die Eier (frisch gelegt oder bis 4 Tage nach der Lege, aus der Linie Gallus gallus Dekalb White) in eine 0,2%ige verdünnte Lösung von Natriumhypochlorit, spülen Sie sie schnell unter fließendem Wasser ab und wischen Sie s...

<ol>
	<li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies.">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).</li><li>de Figueiredo, A. M., Gl&#243;ria, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mari&#250;ba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry:+A+review.">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+bead-based+multiplexing.">The genesis and evolution of bead-based multiplexing.</a> Methods. 158, 2-11 (2019).</li><li>Kellar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microsphere-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays.</a> Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).</li><li>Schade, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+A+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins+in+the+control+of+terrestrial+and+aquatic+animal+diseases:+A+review.">Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review.</a> Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments.">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).</li><li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li><li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk.">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).</li><li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents.">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li><li>Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgY+Technology:+Extraction+of+chicken+antibodies+from+egg+yolk+by+polyethylene+glycol+(PEG)+precipitation.">IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).</li><li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides.">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li><li>Ko, K. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+immunoglobulin+Y+from+egg+yolk+using+ammonium+sulfate+precipitation+and+ion+exchange+chromatography.">Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.</a> Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+IgY+from+the+yolks+of+eggs+by+a+chloroform+polyethylene+glycol+procedure.">Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure.</a> Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).</li><li>Simonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xMAP-based+analysis+of+three+most+prevalent+staphylococcal+toxins+in+Staphylococcus+aureus+cultures.">xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+for+detection+of+staphylococcal+and+streptococcal+exotoxins.">A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins.</a> PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).</li><li>Merbah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+a+cytometric+p24-capture+bead-assay+for+the+detection+of+main+HIV-subtypes.">Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes.</a> Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).</li></ol>

Die Methode der Fällung des IgY-Antikörpers durch pH-Reduktion mit anschließender Lipidtrennung mit Caprylsäure ist effizient bei der Isolierung von Gesamtantikörpern ohne Funktionsverlust. Die hier vorgeschlagene Methode ist einfacher und billiger als die von Redwan et al.11 beschriebene, die ebenfalls eine Ausfällung durch Versauerung und Caprylsäure verwendeten, jedoch mit einem komplexeren und mühsameren Protokoll. Diese Methode bietet auch Vorteile gegenüber häufig verwendeten Metho...

Unter den Immunoassay-Techniken zur Diagnose von Krankheiten hat sich der zytometrische Bead-Assay als hochempfindlicher und zuverlässiger Ansatz herausgestellt, da er die Analyse von Tausenden von Partikeln in einem einzigen Assay ermöglicht1. Diese Technik bietet nicht nur eine hohe Produktivität und die Verwendung kleinerer Probenvolumina, sondern auch eine große Flexibilität, da sie den Nachweis mehrerer Moleküle wie Zytokine, Adhäsionsmoleküle, Antikörperisotypen und Proteine ermöglicht 2,3.
Für die Entwicklung dieser Assays werden verschiedene Partikel verwendet, darunter Latexperlen, die ein effektiver und kostengünstiger Input sind. Diese können Modifikationen auf ihrer Oberfläche aufweisen, wie z. B. das Vorhandensein funktioneller Gruppen oder Proteine, die die kovalente oder nicht-kovalente Kopplung bestimmter Moleküle ermöglichen 3,4,5.
Diese Immunoassays verwenden Komponenten wie Antigene und Antikörper, um den Nachweis von Krankheitsmarkern durchzuführen, und erfordern in der Regel Antikörper von Säugetieren wie Mäusen, Kaninchen und Ziegen. Dies führt zu ethischen Problemen, da die Immunisierung von Säugetieren in der Regel viele Tiere erfordert, um einen guten Ertrag zu erzielen, sowie die häufige Durchführung von Verfahren, die zum Leiden der Tiere führen 6,7. Eine Alternative dazu ist die Verwendung von IgY-Antikörpern, die aus dem Eigelb immunisierter Hühner isoliert wurden, da im Eigelb hohe Konzentrationen der spezifischen Antikörper gegen die inokulierten Antigene zu finden sind; Die Produktion eines Huhns entspricht der Produktion von 4,3 Kaninchen im Laufe eines Jahres 6,7.
Daher ist es das Ziel dieses Protokolls, eine Methode zur Bewertung von IgY-Antikörpern bereitzustellen, die aus Hühnereigelb mittels Durchflusszytometrie mit Latexkügelchen gewonnen wurden. Zu diesem Zweck schlagen wir eine Standardisierungsmethode für einen zytometrischen Bead-Immunoassay im Sandwich-Format unter Verwendung von Latex-Beads vor. Als Modell haben wir IgY-Antikörper verwendet, die gegen das histidinreiche Protein-II-Antigen Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2) gerichtet sind. Wir beschreiben eine Methode zur Extraktion der Antikörper, diskutieren die kritischen Schritte zur Bestimmung der Kopplungskonzentration dieser Antikörper an die Latexkügelchen und präsentieren eine Bewertung der Nachweisgrenze des Antigens. Die hohe Genauigkeit der Durchflusszytometrie, gepaart mit den niedrigen Kosten von Latexkügelchen, machen diese Technik für die Analyse von Immunoassay-Werkzeugen wie Antikörpern und Antigenen anwendbar. Diese Methode kann für die Detektion verschiedener Ziele verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF&#160;488A antibody produced in donkey</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#8242;)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BF-FACSC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T research beads (CS&#38;T research beads)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software 7.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloride 37% acid molecular grade</td>
			<td>NEON</td>
			<td>02618 NEON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML latex, 4% w/v</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-HM8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003335620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>P.10.0594.024.00.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>R09211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer Heat/Cool</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K80-120R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies

Immunoassays sind wichtige Tests für den Nachweis zahlreicher molekularer Ziele. Unter den derzeit verfügbaren Methoden hat der zytometrische Bead-Assay in den letzten Jahrzehnten an Bedeutung gewonnen. Jede Mikrosphäre, die vom Gerät gelesen wird, stellt ein Analyseereignis der Wechselwirkungskapazität zwischen den zu testenden Molekülen dar. Tausende dieser Ereignisse werden in einem einzigen Assay abgelesen, wodurch eine hohe Assaygenauigkeit und Reproduzierbarkeit gewährleistet wird. Diese Methodik kann auch bei der Validierung neuer Inputs, wie z. B. IgY-Antikörper, für die Diagnose von Krankheiten eingesetzt werden. Diese Antikörper werden gewonnen, indem Hühner mit dem interessierenden Antigen immunisiert und dann das Immunglobulin aus dem Eigelb der Tiere extrahiert wird. Daher ist dies eine schmerzfreie und hochproduktive Methode zur Gewinnung der Antikörper. Neben einer Methodik zur hochpräzisen Validierung der Antikörpererkennungskapazität dieses Assays wird in dieser Arbeit auch eine Methode zur Extraktion dieser Antikörper, zur Bestimmung der besten Kopplungsbedingungen für die Antikörper und Latexkügelchen und zur Bestimmung der Sensitivität des Tests vorgestellt.

Abbildung 2 zeigt eine grafische Darstellung des Extraktionsprozesses von IgY-Antikörpern durch Ansäuerung und anschließende Trennung mit Caprylsäure (Abbildung 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung des Extraktionsschritts von IgY-Antikörpern und der Tre...

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Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Herstellung von Latexkügelchen für Assays mit IgY-Antikörpern für den Antigennachweis.

Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays auf Basis von Eigelb-Antikörpern

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

Unter den Immunoassay-Techniken, die auf die Diagnose von Krankheiten abzielen, hat sich der zytometrische Bead-Assay als hochempfindlicher und zuverlässiger Ansatz erwiesen, der Tausende von Partikeln in einem einzigen Assay analysiert. Die hohe Genauigkeit der Durchflusszytometrie, gepaart mit den niedrigen Kosten von Latexkügelchen, machen unsere Technik für die Analyse von Immunoassays-Werkzeugen wie Antikörpern und Antigenen anwendbar. IgY-Antikörper haben niedrige Kosten und ethische Vorteile bei ihrer Herstellung und können als Nachweisinstrument für seltene Krankheiten verwendet werden.Beginnen Sie damit, die frisch gelegten oder vier Tage alten Eier der Linie Gallus gallus Deckle White in eine 0,2%ige verdünnte Lösung von Natriumhypochlorit zu tauchen. Spülen Sie sie schnell unter fließendem Wasser ab und wischen Sie sie vorsichtig ab. Das Ei vorsichtig aufschlagen, das Eigelb mit Hilfe eines Eigelbabscheiders vom Eiweiß trennen.Und entfernen Sie das überschüssige Weiß mit Filterpapier. Stechen Sie das Eigelb ein und sammeln Sie sein Inneres in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Lagern Sie das Eigelb vor der Anwendung mindestens 24 Stunden bei minus 20 Grad Celsius.Nachdem Sie das gelagerte Eigelb aufgetaut haben, verdünnen Sie es im Verhältnis eins zu 10 in einem millimolaren PBS. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einer normalen Salzsäure auf fünf ein und inkubieren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius für sechs bis 24 Stunden. Die Lösung wird 40 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert und der zurückgewonnene Überstand mit einem 0,7-Millimeter-Zellulosefilter filtriert, bevor der pH-Wert des Überstands auf fünf eingestellt wird.Caprylsäure wird unter ständigem Rühren 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bis zu einer Endkonzentration von 8,7 % zugegeben. Nachdem Sie die Proben 15 Minuten lang zentrifugiert haben, trennen Sie den Überstand vom gefällten Material. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem molaren Natriumhydroxid auf 7,4 um.Und quantifizieren Sie die Antikörper mit dem Bradford-Assay, bevor Sie sie bei minus 20 Grad Celsius lagern. Füge 21 Mikroliter EDC und 21 Mikroliter NHS zu 21 Mikrolitern Latexkügelchen hinzu. Und stellen Sie sich auf ein Endvolumen von 2,1 Millilitern ein, mit gefiltertem 10 Millimolar PBS.Die Lösung wird bei 22 Grad Celsius unter schnellem Schütteln drei Stunden lang inkubiert. Geben Sie den zuvor extrahierten Fängerantikörper IgY PfHRP2 in verschiedene Mikroröhrchen, die 100 Mikroliter dieser Lösung enthalten. Und erneut 16 Stunden inkubieren.Nach dem Zentrifugieren der Proben und dem Verwerfen der Überstände werden die Latexkügelchen zweimal mit 500 Mikrolitern gefiltertem 10 Millimolar PBS gewaschen, wobei Zentrifugations- und Resuspensionszyklen verwendet werden. Für die Blockierung der Kügelchen werden die Proben in einem Milliliter Blockierungspuffer resuspendiert und befolgen Sie das gleiche zuvor gezeigte Verfahren, um sie zwei Stunden lang zu inkubieren. Nachdem Sie die Kügelchen mit PBS gewaschen haben, resuspendieren Sie sie erneut in 10 Millimolar PBS-Puffer.In jedes Mikroröhrchen werden 100 Mikroliter fluoreszierender Anti-Hühner-Antikörper, verdünnt auf eins zu 2000 in einer 10-millimolaren Mischung aus PBS und BSA, gegeben. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln. Nachdem Sie die Perlen gewaschen haben, resuspendieren Sie sie erneut mit 250 Mikrolitern gefiltertem 10 Millimolar PBS.Die Nachweisgrenze wird bestimmt, indem 100 Mikroliter des blockierten Kügelchenpräparats in Röhrchen verteilt werden, die unterschiedliche Mengen des verdünnten rekombinanten Proteins PfHRP2 in dreifacher Ausführung enthalten. Die Kügelchenlösungen mit dem Protein bei 22 Grad Celsius unter schnellem Schütteln eine Stunde lang inkubieren. Waschen Sie die Kügelchen mit 500 Mikrolitern gefiltertem 10 Millimolar PBS unter Zentrifugation, wie zuvor gezeigt.Nach dem Verwerfen des Überstandes werden zwei Mikrogramm Maus-IgG-Antikörper gegen das rekombinante Protein, verdünnt in 10 Millimolar PBS und BSA, in jede Probe gegeben und das gleiche Verfahren für die Inkubation befolgt. Als nächstes werden 100 Mikroliter des verdünnten fluoreszierenden Anti-Maus-Antikörpers zu jeder Probe gegeben. Nach der Inkubation wird die Probe in 250 Mikroliter filtriertem 10 Millimolar PBS resuspendiert.Schalten Sie den Computer und das Durchflusszytometer ein und warten Sie einige Minuten, bis das Gerät eine Verbindung zum Computer hergestellt hat. Klicken Sie auf die auf dem Computer installierte Zytometrie-Software und melden Sie sich an. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software Zytometer, gefolgt von Fluidik-Start, Reinigungsmodi und SIT-Spülung aus.Definieren Sie die Gating-Strategie basierend auf den morphometrischen und Fluoreszenzeigenschaften des Negativkontrollpartikels. Um die Zellmorphometrie zu bestimmen, wählen Sie für die Analyse der Parameter der Vorwärtsstreuung A die Punktplotgrafik mit der Seitenstreuung A.Bestimmen Sie die einzelnen Zellen durch die Seitenstreuung mit der Punktplotgrafik für die Analyse der Seitenstreuung W in der Y-Achse und der Seitenstreuung H in der X-Achse. Und bestimmen Sie die einzelnen Zellen durch Vorwärtsstreuung, indem Sie die Punktdiagrammgrafik für die Analyse der Vorwärtsstreuung W auf der Y-Achse und der Vorwärtsstreuung H auf der X-Achse verwenden.Wählen Sie für die Fluoreszenzanalyse FL1-Punktdiagramme mit Vorwärtsstreuung A. Verwenden Sie ein Styroporröhrchen mit Stopfen und Proben, die zuvor mit einfarbigem Alexa Fluor 488 markiert wurden, und mischen Sie den Inhalt des Röhrchens vorsichtig. Befestigen Sie das Röhrchen an der Durchflusszytometersonde und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Erfassen. Um die Leistung der Laser einzustellen, klicken Sie auf Parameter und stellen Sie in den folgenden Optionen die Spannung der Durchlassstreuung auf 182 Volt und die Spannung der Seitenstreuung auf 236 Volt ein.Um den Schwellenwert am Zytometer einzustellen, klicken Sie auf Schwellenwert und stellen Sie in den folgenden Optionen die FSC auf 500 Volt ein. Stellen Sie das Analysegatter ein, um Partikel nach Größe und Komplexität zu charakterisieren und Einzelzellanalysen durchzuführen. Entfernen Sie die Autofluoreszenz, indem Sie die farbstofffreie Probe, die nur die Latexkügelchen enthält, analysieren und die Spannung des Detektors FL1 FITC auf 332 Volt einstellen.Stellen Sie das Fluoreszenzanalyse-Gate im viereckigen Format ein, ausgehend von dem negativen Punkt, der im Punktdiagramm angezeigt wird. Nachdem die morphometrischen und fluoreszierenden Analysen angepasst wurden, konfigurieren Sie das Gerät für 50.000 Ereignisse und klicken Sie auf Aufzeichnen. Die elektrophoretischen Profile des IgY-PfHRP2-Antikörpers, bedingt durch die Trennung mit Caprylsäure, sind hier dargestellt.Aus dieser Abbildung ist ersichtlich, dass die Antikörper vor und nach der Caprylsäuretrennung ähnliche elektrophoretische Profile aufwiesen, mit charakteristischen Banden von 65 Kilodalton und 27 Kilodalton, die sich auf die leichten und schweren Ketten des IgY beziehen. Darüber hinaus sind auch andere Banden sichtbar, wahrscheinlich aufgrund des C-terminalen Eigelbprotein-Vitellogenin-II-Vorläufers. Die Beurteilung der Antikörpersättigungskonzentration auf Latexkügelchen ist für die Entwicklung eines Immunoassays mit den Kügelchen von entscheidender Bedeutung.Eine Kurve der prozentualen Fluoreszenz verschiedener Konzentrationen von Antikörpern, gekoppelt an jeden Mikroliter kommerzieller Latexkügelchen, ist hier dargestellt. Mit steigender Konzentration stiegen auch die Prozentwerte an und erreichten ein Plateau bei zwei Mikrogramm Antikörperkonzentration, was sie als optimale Kopplungskonzentration für den Zielantigen-Immunoassay etablierte. Die Nachweisgrenze wurde bestimmt, indem der Fluoreszenzprozentsatz der Latexgeschwindigkeitsreaktivität gegen unterschiedliche rPfHRP2-Proteinkonzentrationen bestimmt wurde.Bei einem Sandwich-Immunoassay wurde beobachtet, dass die Fluoreszenz ab 0,01 Mikrogramm PfHRP2-Protein erhöht war und bei 0,1 Mikrogramm ein Plateau erreichte. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Fluoreszenz bei null Mikrogramm und 0,01 Mikrogramm. Ein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenz wurde jedoch bei 0,01 Mikrogramm, 0,1 Mikrogramm und 10 Mikrogramm beobachtet.Der Waschschritt dieses Protokolls ist entscheidend, um den Verlust von Perlen zu vermeiden. Das Messgerät muss gut definiert sein, damit das erzielte Ergebnis keine Fehler aufweist. Die hier beschriebenen Schritte stellen eine wichtige Standardisierung dar, die notwendig ist, um die Zuverlässigkeit der diagnostischen Tests mit Latexkügelchen zu gewährleisten, die mittels Vollzytometrie ausgewertet werden.Daher ist diese Methodik eine Alternative zu den klassischen Sandwich-Testmodellen. Diese Methode kann auf verschiedene Arten von Assays angewendet werden und eignet sich sowohl für die Übertragung mehrerer Moleküle auf die Oberfläche der Kügelchen als auch für die Detektion verschiedener Analyten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Untersuchungen von Chaperon-Cochaperon-Interaktionen mit homogenem Bead-based Assay

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...