Name: standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies at JoVE.com

ברצוננו להודות ל- FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), לתוכנית לתואר שני בביוטכנולוגיה (PPGBIOTEC באוניברסיטה הפדרלית של אמזונס - UFAM), ל- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES), ול- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) על מתן המלגות. איור 2 ואיור 4 נוצרו עם biorender.com.

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. מיצוי IgY מחלמונים
<ol><li>היגינזציה של הביצים<ol><li>יש לטבול את הביצים (טריות שהוטלו או עד 4 ימים לאחר ההטלה, משושלת Gallus gallus Dekalb White) בתמיסה מדוללת 0.2% של נת?...

<ol>
	<li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies.">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).</li><li>de Figueiredo, A. M., Gl&#243;ria, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mari&#250;ba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry:+A+review.">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+bead-based+multiplexing.">The genesis and evolution of bead-based multiplexing.</a> Methods. 158, 2-11 (2019).</li><li>Kellar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microsphere-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays.</a> Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).</li><li>Schade, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+A+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins+in+the+control+of+terrestrial+and+aquatic+animal+diseases:+A+review.">Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review.</a> Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments.">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).</li><li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li><li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk.">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).</li><li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents.">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li><li>Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgY+Technology:+Extraction+of+chicken+antibodies+from+egg+yolk+by+polyethylene+glycol+(PEG)+precipitation.">IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).</li><li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides.">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li><li>Ko, K. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+immunoglobulin+Y+from+egg+yolk+using+ammonium+sulfate+precipitation+and+ion+exchange+chromatography.">Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.</a> Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+IgY+from+the+yolks+of+eggs+by+a+chloroform+polyethylene+glycol+procedure.">Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure.</a> Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).</li><li>Simonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xMAP-based+analysis+of+three+most+prevalent+staphylococcal+toxins+in+Staphylococcus+aureus+cultures.">xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+for+detection+of+staphylococcal+and+streptococcal+exotoxins.">A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins.</a> PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).</li><li>Merbah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+a+cytometric+p24-capture+bead-assay+for+the+detection+of+main+HIV-subtypes.">Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes.</a> Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).</li></ol>

שיטת המשקעים של נוגדן IgY על ידי הפחתת pH ואחריה הפרדת שומנים באמצעות חומצה קפרילית יעילה בבידוד סך הנוגדנים ללא כל אובדן פונקציונליות. השיטה המוצעת כאן פשוטה וזולה יותר מזו שדווחה על ידי Redwan et al.11, שהשתמשו גם במשקעים על ידי החמצה וחומצה קפרילית אך עם פרוטוקול מורכב ומייגע יותר. ?...

בין טכניקות immunoassay שמטרתן לאבחן מחלות, בדיקת החרוזים הציטומטרית התפתחה כגישה רגישה ואמינה ביותר, שכן היא מאפשרת ניתוח של אלפי חלקיקים בבדיקה אחת1. טכניקה זו, בנוסף לפרודוקטיביות גבוהה ומאפשרת שימוש בכמויות קטנות יותר של דגימות, מציגה גם גמישות רבה, שכן היא מאפשרת זיהוי של מספר מולקולות, כגון ציטוקינים, מולקולות הידבקות, איזוטיפים נוגדנים וחלבונים 2,3.
חלקיקים שונים משמשים לפיתוח בדיקות אלה, ביניהם חרוזי לטקס, המהווים תשומה יעילה וזולה. אלה יכולים להציג שינויים על פני השטח שלהם, כגון נוכחות של קבוצות פונקציונליות או חלבונים המאפשרים צימוד קוולנטי או לא קוולנטי של מולקולות מסוימות 3,4,5.
בדיקות חיסוניות אלה משתמשות ברכיבים כגון אנטיגנים ונוגדנים כדי לבצע זיהוי של סמני מחלה ובדרך כלל דורשות נוגדנים מיונקים כגון עכברים, ארנבות ועזים. זה יוצר בעיות הקשורות לסוגיות אתיות, שכן חיסון של יונקים בדרך כלל דורש בעלי חיים רבים כדי להשיג תשואה טובה, כמו גם את הביצועים התכופים של נהלים המובילים לסבל של בעלי חיים 6,7. חלופה לכך היא שימוש בנוגדני IgY שבודדו מחלמוני הביצה של תרנגולות מחוסנות, שכן ניתן למצוא בחלמונים ריכוזים גבוהים של נוגדנים ספציפיים כנגד האנטיגנים המחוסנים; הייצור של עוף שווה לייצור של 4.3 ארנבות במהלך שנה 6,7.
לפיכך, מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה להערכת נוגדני IgY המתקבלים מחלמוני ביצת תרנגולת באמצעות ציטומטריית זרימה עם חרוזי לטקס. לשם כך, אנו מציעים שיטת סטנדרטיזציה עבור immunoassay חרוז ציטומטרי בפורמט סנדוויץ' באמצעות חרוזי לטקס. כמודל, השתמשנו בנוגדני IgY המכוונים לאנטיגן Plasmodium falciparum histidine-עשיר בחלבון II (IgY-PfHRP2). אנו מתארים שיטה לחילוץ הנוגדנים, דנים בשלבים הקריטיים להגדרת ריכוז הצימוד שלהם לחרוזי הלטקס, ומציגים הערכה של גבול הזיהוי של האנטיגן. הדיוק הגבוה של ציטומטריית זרימה, יחד עם העלות הנמוכה של חרוזי לטקס, הופכים טכניקה זו לישימה לניתוח כלים חיסוניים, כגון נוגדנים ואנטיגנים. שיטה זו יכולה לשמש לאיתור מטרות מגוונות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF&#160;488A antibody produced in donkey</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#8242;)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BF-FACSC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T research beads (CS&#38;T research beads)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software 7.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloride 37% acid molecular grade</td>
			<td>NEON</td>
			<td>02618 NEON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML latex, 4% w/v</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-HM8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003335620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>P.10.0594.024.00.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>R09211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer Heat/Cool</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K80-120R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies

בדיקות חיסוניות הן בדיקות חשובות לזיהוי מטרות מולקולריות רבות. בין השיטות הקיימות כיום, בדיקת החרוזים הציטומטריים זכתה לבולטות בעשורים האחרונים. כל מיקרוספירה שנקראת על ידי הציוד מייצגת אירוע ניתוח של יכולת האינטראקציה בין המולקולות הנבדקות. אלפי אירועים אלה נקראים בבדיקה אחת, ובכך מבטיחים דיוק ושחזור גבוהים של הבדיקה. מתודולוגיה זו יכולה לשמש גם באימות של תשומות חדשות, כגון נוגדנים IgY, לאבחון מחלות. נוגדנים אלה מתקבלים באמצעות חיסון תרנגולות עם האנטיגן של עניין ולאחר מכן חילוץ אימונוגלובולין מן החלמון של ביצים של בעלי חיים; לכן, זוהי שיטה ללא כאבים ופרודוקטיבית מאוד להשגת הנוגדנים. בנוסף למתודולוגיה לאימות מדויק של יכולת זיהוי הנוגדנים של בדיקה זו, מאמר זה מציג גם שיטה לחילוץ נוגדנים אלה, קביעת תנאי הצימוד הטובים ביותר עבור הנוגדנים וחרוזי הלטקס, וקביעת רגישות הבדיקה.

איור 2 מספק ייצוג גרפי של תהליך מיצוי נוגדני IgY באמצעות החמצה, ואחריו הפרדה באמצעות חומצה קפרילית (איור 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> איור 2: ייצוג סכמטי של שלב מיצוי נוגדני IgY...

Watch this Scientific Journal Video about Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies at JoVE.com

Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להכנת חרוזי לטקס לבדיקות באמצעות נוגדני IgY לזיהוי אנטיגן.

סטנדרטיזציה של בדיקת חרוזים ציטומטרית המבוססת על נוגדנים לחלמון ביצה

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

בין טכניקות החיסון שמטרתן לאבחן מחלות, בדיקת החרוזים הציטומטרית התפתחה כגישה רגישה ואמינה ביותר, המנתחת אלפי חלקיקים בבדיקה אחת. הדיוק הגבוה של ציטומטריית זרימה, יחד עם העלות הנמוכה של חרוזי לטקס, הופכים את הטכניקה שלנו לישימה לניתוח כלים חיסוניים, כגון נוגדנים ואנטיגנים. נוגדני IgY הם בעלי עלות נמוכה, והיתרונות האתיים בייצורם, ויכולים לשמש ככלי זיהוי למחלות נדירות.התחילו בטבילת הביצים הטריות או בנות ארבעת הימים, מהשושלת הלבנה Gallus gallus deckle, בתמיסה מדוללת של 0.2% של נתרן היפוכלוריט. שטפו אותם במהירות תחת מים זורמים ונגבו בעדינות. שוברים את הביצה בזהירות, מפרידים את החלמון מהלבן בעזרת מפריד חלמונים.והסר את עודפי הלבן בעזרת נייר סינון. מנקבים את החלמון, ואוספים את חלקו הפנימי לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. אחסנו את החלמון בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לפחות 24 שעות לפני השימוש.לאחר הפשרת החלמון המאוחסן, מדללים אותו ביחס של אחד עד 10 במילימולר PBS. התאימו את רמת החומציות של התמיסה לחמש, עם חומצה הידרוכלורית רגילה אחת, ודגרו על התמיסה בארבע מעלות צלזיוס למשך שש עד 24 שעות. צנטריפוגו את התמיסה ב-3000 גרם למשך 40 דקות, וסננו את הסופרנאטנט המשוחזר באמצעות מסנן תאית 0.7 מילימטר, לפני התאמת ה-pH של הסופרנאטנט לחמישה.מוסיפים חומצה קפרילית לריכוז סופי של 8.7% תוך ערבוב מתמיד, למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה של הדגימות במשך 15 דקות, להפריד את supernatant מן החומר המושקע. התאם מחדש את ה- pH של התמיסה ל- 7.4 באמצעות נתרן הידרוקסידי מולרי אחד.ולכמת את הנוגדנים באמצעות בדיקת ברדפורד, לפני אחסונם במינוס 20 מעלות צלזיוס. הוסף 21 מיקרוליטר של EDC, ו 21 מיקרוליטר של NHS, ל 21 מיקרוליטר של חרוזי לטקס. והתכוונן לנפח סופי של 2.1 מיליליטר, עם PBS מסונן של 10 מילימולרי.לדגור על התמיסה ב 22 מעלות צלזיוס, עם רעידות מהירות, במשך שלוש שעות. הוסף את נוגדן הלכידה שחולץ בעבר, IgY PfHRP2, למיקרו צינורות שונים המכילים 100 מיקרוליטר של פתרון זה. ולדגור שוב במשך 16 שעות.לאחר צנטריפוגה של הדגימות והשלכת הסופרנאטנטים, שטפו את חרוזי הלטקס פעמיים עם 500 מיקרוליטר של PBS 10 מילימולרי מסונן, באמצעות מחזורי צנטריפוגה ותרחיף. לחסימת החרוזים, השהה מחדש את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ חוסם, ופעל באותו הליך שהוצג קודם לכן כדי לדגור עליו במשך שעתיים. לאחר שטיפת החרוזים עם PBS, השהה אותם שוב במאגר PBS של 10 מילימולרי.הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן פלואורסצנטי נגד עוף, מדולל לאחד עד 2000 בתערובת 10 מילימולרית של PBS ו- BSA, לכל מיקרו. לדגור על הדגימות בחושך במשך 30 דקות. לאחר שטיפת החרוזים, להשעות אותם שוב עם 250 מיקרוליטר של PBS מסונן 10 מילימולרי.קבע את גבול הזיהוי על ידי הפצת 100 מיקרוליטר של הכנת החרוזים החסומים, לתוך צינורות המכילים כמויות שונות של חלבון רקומביננטי מדולל PfHRP2 במשולש. לדגור על תמיסות החרוזים עם החלבון ב 22 מעלות צלזיוס, עם רעידות מהירות, במשך שעה אחת. לשטוף את החרוזים עם 500 מיקרוליטר של PBS מסונן 10 מילימולרי, עם צנטריפוגה, כפי שהודגם בעבר.לאחר השלכת הסופרנאטנט יש להוסיף שני מיקרוגרם של נוגדן IgG עכברי כנגד החלבון הרקומביננטי, מדולל ב-PBS ו-BSA של 10 מילימולר לכל דגימה, ולבצע את אותו הליך לדגירה. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן פלואורסצנטי מדולל נגד עכבר לכל דגימה. לאחר הדגירה, להשעות מחדש את הדגימה ב 250 מיקרוליטר של PBS מסונן 10 מילימולרי.הפעל את המחשב ואת ציטומטר הזרימה והמתן מספר דקות עד שהציוד יתחבר למחשב. לחץ על תוכנת הציטומטריה המותקנת במחשב והיכנס אליה. מסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer, ואחריו Fluidics Startup, Cleaning Modes ו-SIT Flush.הגדירו את אסטרטגיית ה-gating בהתבסס על המאפיינים המורפומטריים והפלואורסצנטיים של חלקיק הבקרה השלילי. כדי לקבוע את מורפומטריית התא, בחר גרפיקת התוויית נקודה לניתוח פרמטרי פיזור קדימה A באמצעות פיזור צד A. קבע את התאים הבודדים לפי פיזור צד באמצעות גרפיקת התוויית נקודה לניתוח פיזור צד W בציר Y, ופיזור צד H בציר X. ולקבוע את התאים הבודדים על ידי פיזור קדימה, באמצעות גרפיקת התוויית התוויית נקודות, לניתוח פיזור W קדימה בציר Y, ופיזור קדימה H בציר X.לניתוח פלואורסצנטיות, בחר תרשימי תרשים נקודות FL1 באמצעות פיזור קדימה A. השתמש בשפופרת פוליסטירן עצורה המכילה דגימות ללא תווית, ודגימות שסומנו בעבר עם אלקסה פלואור 488 בצבע יחיד וערבב בזהירות את תכולת הצינור. חבר את הצינור לבדיקת ציטומטר הזרימה, ולחץ לחיצה שמאלית על Acquire. כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים, לחץ על פרמטרים, ובאפשרויות שלהלן, התאם את מתח הפיזור הקדמי ל -182 וולט, ואת מתח הפיזור הצדדי ל -236 וולט.כדי להגדיר את הסף על ציטומטר, לחץ על סף, ובאפשרויות הבאות, להתאים את FSC ל 500 וולט. הגדר את שער הניתוח כדי לאפיין חלקיקים לפי גודל ומורכבות, כמו גם לבצע ניתוח תא בודד. הסר אוטופלואורסצנטיות על ידי ניתוח הדגימה נטולת הצבע המכילה רק את חרוזי הלטקס, והתאמת המתח של הגלאי FL1 FITC ל -332 וולט.הגדר את שער ניתוח הפלואורסצנטיות בתבנית מרובעת, מהנקודה השלילית המוצגת בגרף תרשים תרשים הנקודות. לאחר התאמת הניתוחים המורפומטריים והפלואורסצנטיים, הגדר את המכשיר עבור 50, 000 אירועים ולחץ על הקלט. הפרופילים האלקטרופורטיים של נוגדן IgY PfHRP2, עקב ההפרדה באמצעות חומצה קפרילית, מוצגים כאן.מנתון זה ניתן לראות כי הנוגדנים לפני ואחרי הפרדת החומצה הקפרילית הראו פרופילים אלקטרופורטיים דומים, עם רצועות אופייניות של 65 קילודלטון ו -27 קילודלטון, המתייחסות לשרשראות הקלות והכבדות של ה- IgY. בנוסף לאלה, ניתן לראות גם להקות אחרות, ככל הנראה בשל מבשר חלבון חלמון ביצה מסוג C terminal protein vitellogenin II. הערכת ריכוז רוויית הנוגדנים בחרוזי לטקס, חיונית לפיתוח בדיקה חיסונית עם החרוזים.עקומה של אחוז הפלואורסצנטיות של ריכוזים שונים של נוגדנים, המצומדים לכל מיקרוליטר של חרוזי לטקס מסחריים בשימוש, מוצגת כאן. ככל שהריכוז עלה, גם ערכי האחוזים עלו, והגיעו לשני מיקרוגרם של ריכוז נוגדנים, מה שקבע אותו כריכוז הצימוד האופטימלי לאימונואסי האנטיגן המטרה. מגבלת הזיהוי נקבעה על ידי הערכת אחוז הפלואורסצנטיות של תגובתיות מהירות לטקס כנגד ריכוזים משתנים של חלבון rPfHRP2.מאימונואסיית סנדוויץ', נצפה כי הפלואורסצנטיות הוגדלה מ -0.01 מיקרוגרם של חלבון PfHRP2, ומישורית ב -0.1 מיקרוגרם. לא היה הבדל משמעותי בפלואורסצנטיות באפס מיקרוגרם ו-0.01 מיקרוגרם. עם זאת, הבדל משמעותי בפלואורסצנטיות נצפה ב -0.01 מיקרוגרם, 0.1 מיקרוגרם ו -10 מיקרוגרם.שלב הכביסה של פרוטוקול זה הוא קריטי כדי למנוע אובדן חרוזים. המד חייב להיות מוגדר היטב, כך שלא יהיו טעויות בתוצאה שהושגה. השלבים המתוארים כאן מייצגים סטנדרטיזציה חשובה, הנחוצה כדי להבטיח את אמינות בדיקות האבחון באמצעות חרוזי לטקס המוערכים באמצעות ציטומטריה מלאה.לכן, מתודולוגיה זו היא חלופה למודלים הקלאסיים של בדיקת סנדוויץ'. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים שונים של בדיקות, ועשויה להתאים להתמודדות של מספר מולקולות על פני השטח של החרוזים, כמו גם לזיהוי של אנליטים שונים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

בסיס אלקטרוכימי מבוסס-מיניאונציה עבור גרסאות חלבון MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

מחקרים של אינטראקציות מלווה-Cochaperone באמצעות אסאי הומוגני מבוסס חרוזים

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...