Name: standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00
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हम FIOCRUZ ("प्रोग्राम डी एक्सेल-एलेक्सिका और एप्लीकाडा एड ऑफ इंस्टीट्यूटो लेओनिडास और मारिया डीन - ILMD / Fiocruz Amazonia-PROEP-LABS / ILMD FIOCRUZ AMAZONIA"), जैव प्रौद्योगिकी में स्नातकोत्तर कार्यक्रम (Universidad Federal do Amazonas - UFAM में PPGBIOTEC), Coordenaço de Aperfeiçoamento de Pessoal de Apples (Apes) को धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्र 2 और चित्रा 4 biorender.com के साथ बनाए गए थे।

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. अंडे की जर्दी से आईजीवाई का निष्कर्षण
<ol><li>अंडे ?...

<ol>
	<li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies.">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).</li><li>de Figueiredo, A. M., Gl&#243;ria, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mari&#250;ba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry:+A+review.">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments.">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).</li><li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li><li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk.">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).</li><li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents.">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li><li>Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgY+Technology:+Extraction+of+chicken+antibodies+from+egg+yolk+by+polyethylene+glycol+(PEG)+precipitation.">IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).</li><li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides.">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li><li>Ko, K. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+immunoglobulin+Y+from+egg+yolk+using+ammonium+sulfate+precipitation+and+ion+exchange+chromatography.">Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.</a> Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+IgY+from+the+yolks+of+eggs+by+a+chloroform+polyethylene+glycol+procedure.">Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure.</a> Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).</li><li>Simonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xMAP-based+analysis+of+three+most+prevalent+staphylococcal+toxins+in+Staphylococcus+aureus+cultures.">xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+for+detection+of+staphylococcal+and+streptococcal+exotoxins.">A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins.</a> PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).</li><li>Merbah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+a+cytometric+p24-capture+bead-assay+for+the+detection+of+main+HIV-subtypes.">Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes.</a> Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).</li></ol>

पीएच में कमी के बाद कैप्रिलिक एसिड का उपयोग करके लिपिड पृथक्करण द्वारा आईजीवाई एंटीबॉडी की वर्षा की विधि कार्यक्षमता में किसी भी नुकसान के बिना कुल एंटीबॉडी को अलग करने में कुशल है। यहां प्रस्तावित व?...

रोगों के निदान के उद्देश्य से इम्यूनोएसे तकनीकों में, साइटोमेट्रिक बीड परख एक अत्यधिक संवेदनशील और विश्वसनीय दृष्टिकोण के रूप में उभरा है, क्योंकि यह एक ही परख 1 में हजारों कणों के विश्लेषण की अनुमति देताहै। यह तकनीक, उच्च उत्पादकता होने और नमूनों की छोटी मात्रा के उपयोग की अनुमति देने के अलावा, बहुत लचीलापन भी प्रस्तुत करती है, क्योंकि यह साइटोकिन्स, आसंजन अणुओं, एंटीबॉडी आइसोटाइप्स और प्रोटीन 2,3 जैसे कई अणुओं का पता लगाने की अनुमति देती है।
इन परखों के विकास के लिए विभिन्न कणों का उपयोग किया जाता है, उनमें से लेटेक्स मोती, जो एक प्रभावी और कम लागत वाले इनपुट हैं। ये अपनी सतह पर संशोधन प्रस्तुत कर सकते हैं, जैसे कि कार्यात्मक समूहों या प्रोटीन की उपस्थिति जोकुछ अणुओं 3,4,5 के सहसंयोजक या गैर-सहसंयोजक युग्मन की अनुमति देते हैं।
ये इम्यूनोएसे रोग मार्करों का पता लगाने के लिए एंटीजन और एंटीबॉडी जैसे घटकों का उपयोग करते हैं और आमतौर पर चूहों, खरगोशों और बकरियों जैसे स्तनधारियों से एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। यह नैतिक मुद्दों से संबंधित समस्याएं पैदा करता है, क्योंकि स्तनधारियों के टीकाकरण के लिए आम तौर पर कई जानवरों को अच्छी उपज प्राप्त करने की आवश्यकता होती है, साथ ही प्रक्रियाओं के लगातार प्रदर्शन से जानवरों की पीड़ा होती है। इसका एक विकल्प प्रतिरक्षित मुर्गियों के अंडे की जर्दी से अलग आईजीवाई एंटीबॉडी का उपयोग है, क्योंकि टीका लगाए गए एंटीजन के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी की उच्च सांद्रता जर्दी में पाई जा सकती है; एक चिकन का उत्पादन एक वर्ष 6,7 के दौरान 4.3 खरगोशों के उत्पादन के बराबर है।
इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य लेटेक्स मोतियों के साथ फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके चिकन अंडे की जर्दी से प्राप्त आईजीवाई एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रदान करना है। इसके लिए, हम लेटेक्स मोतियों का उपयोग करके सैंडविच प्रारूप में साइटोमेट्रिक बीड इम्यूनोसे के लिए एक मानकीकरण विधि का प्रस्ताव करते हैं। एक मॉडल के रूप में, हमने प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम हिस्टिडाइन-समृद्ध प्रोटीन द्वितीय एंटीजन (आईजीवाई-पीएफ एचआरपी 2) के लिए निर्देशित आईजीवाई एंटीबॉडी का उपयोग किया। हम एंटीबॉडी निकालने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, लेटेक्स मोतियों में इनकी युग्मन एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा करते हैं, और एंटीजन का पता लगाने की सीमा का मूल्यांकन प्रस्तुत करते हैं। फ्लो साइटोमेट्री की उच्च सटीकता, लेटेक्स मोतियों की कम लागत के साथ मिलकर, इस तकनीक को इम्यूनोसे टूल, जैसे एंटीबॉडी और एंटीजन के विश्लेषण के लिए लागू करती है। इस विधि का उपयोग विविध लक्ष्यों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF&#160;488A antibody produced in donkey</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#8242;)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BF-FACSC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T research beads (CS&#38;T research beads)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software 7.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloride 37% acid molecular grade</td>
			<td>NEON</td>
			<td>02618 NEON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML latex, 4% w/v</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-HM8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003335620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>P.10.0594.024.00.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>R09211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer Heat/Cool</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K80-120R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies

इम्यूनोएसे कई आणविक लक्ष्यों का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण परीक्षण हैं। वर्तमान में उपलब्ध तरीकों में, साइटोमेट्रिक बीड परख ने हाल के दशकों में प्रमुखता प्राप्त की है। उपकरण द्वारा पढ़ा जाने वाला प्रत्येक माइक्रोसेफर्स परीक्षण के तहत अणुओं के बीच बातचीत क्षमता की एक विश्लेषण घटना का प्रतिनिधित्व करता है। इनमें से हजारों घटनाओं को एक ही परख में पढ़ा जाता है, इस प्रकार उच्च परख सटीकता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित होती है। इस पद्धति का उपयोग रोगों के निदान के लिए आईजीवाई एंटीबॉडी जैसे नए इनपुट के सत्यापन में भी किया जा सकता है। इन एंटीबॉडी को मुर्गियों को रुचि के एंटीजन के साथ प्रतिरक्षित करने और फिर जानवरों के अंडे की जर्दी से इम्युनोग्लोबुलिन निकालने के माध्यम से प्राप्त किया जाता है; इसलिए, यह एंटीबॉडी प्राप्त करने के लिए एक दर्द रहित और अत्यधिक उत्पादक तरीका है। इस परख की एंटीबॉडी पहचान क्षमता के उच्च-सटीक सत्यापन के लिए एक पद्धति के अलावा, यह पेपर इन एंटीबॉडी को निकालने, एंटीबॉडी और लेटेक्स मोतियों के लिए सर्वोत्तम युग्मन स्थितियों का निर्धारण करने और परीक्षण की संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए एक विधि भी प्रस्तुत करता है।

चित्रा 2 अम्लीकरण के माध्यम से आईजीवाई एंटीबॉडी की निष्कर्षण प्रक्रिया का एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्व प्रदान करता है, इसके बाद कैप्रिलिक एसिड (चित्रा 2) का उपयोग करके पृथक्करण क?...

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Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

यह प्रोटोकॉल एंटीजन का पता लगाने के लिए आईजीवाई एंटीबॉडी का उपयोग करके परख के लिए लेटेक्स मोतियों की तैयारी के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है।

अंडे की जर्दी एंटीबॉडी के आधार पर एक साइटोमेट्रिक बीड परख का मानकीकरण

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Phospholipid Scramblase गतिविधि का एक प्रतिदीप्ति आधारित परख

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

विद्युत डिटेक्शन ऑफ ड्यूटेरियम काइनेटिक आइसोटोप प्रभाव में Extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन पर Shewanella oneidensis एमआर-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

जीवाणु रोगजनक फैटी एसिड समावेश के अध्ययन के लिए चिकन अंडे Yolk से लाइपोप्रोटीन कणों का अलगाव झिल्ली Phospholipids में शामिल

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

PRESTO-टैंगो परख का उपयोग कर एक GPCR-वाइड पैमाने पर लिगांड स्क्रीनिंग के लिए 2 भर्ती के समानांतर पूछताछ

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

एक सेल आधारित एस्ट्रोजन रिसेप्टर β रिपोर्टर परख का उपयोग कर फाइटोएस्ट्रोजेन के लिए स्क्रीनिंग

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

MeCP2 प्रोटीन वेरिएंट के लिए एक इलेक्ट्रोकेमिल्यूमिनेसेंस-आधारित परख

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

अनुवाद विनियमन में आरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

समरूप मनका-आधारित परख का उपयोग करके चैपरोन-कोचेपरोन इंटरैक्शन का अध्ययन

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...