Name: standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00
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Ringraziamo il FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), il Programma post-laurea in Biotecnologie (PPGBIOTEC presso l'Universidade Federal do Amazonas - UFAM), il Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) e la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) per aver fornito le borse di studio. La Figura 2 e la Figura 4 sono state create con biorender.com.

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Estrazione delle IgY dai tuorli d'uovo
<ol><li>Igienizzazione delle uova<ol><li>Immergere le uova (appena deposte o fino a 4 giorni dopo la deposizione, del lignaggio Gallus gallus Dekalb White) in una soluzione diluita allo 0,2% di ipoclorito di sodio, sciacquare rapidamente sotto l'acqua corrente e strof...

<ol>
	<li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies.">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).</li><li>de Figueiredo, A. M., Gl&#243;ria, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mari&#250;ba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry:+A+review.">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+bead-based+multiplexing.">The genesis and evolution of bead-based multiplexing.</a> Methods. 158, 2-11 (2019).</li><li>Kellar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microsphere-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays.</a> Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).</li><li>Schade, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+A+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins+in+the+control+of+terrestrial+and+aquatic+animal+diseases:+A+review.">Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review.</a> Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments.">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).</li><li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li><li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk.">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).</li><li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents.">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li><li>Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgY+Technology:+Extraction+of+chicken+antibodies+from+egg+yolk+by+polyethylene+glycol+(PEG)+precipitation.">IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).</li><li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides.">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li><li>Ko, K. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+immunoglobulin+Y+from+egg+yolk+using+ammonium+sulfate+precipitation+and+ion+exchange+chromatography.">Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.</a> Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+IgY+from+the+yolks+of+eggs+by+a+chloroform+polyethylene+glycol+procedure.">Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure.</a> Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).</li><li>Simonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xMAP-based+analysis+of+three+most+prevalent+staphylococcal+toxins+in+Staphylococcus+aureus+cultures.">xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+for+detection+of+staphylococcal+and+streptococcal+exotoxins.">A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins.</a> PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).</li><li>Merbah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+a+cytometric+p24-capture+bead-assay+for+the+detection+of+main+HIV-subtypes.">Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes.</a> Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).</li></ol>

Il metodo di precipitazione dell'anticorpo IgY mediante riduzione del pH seguita da separazione lipidica mediante acido caprilico è efficiente nell'isolare gli anticorpi totali senza alcuna perdita di funzionalità. Il metodo qui proposto è più semplice ed economico di quello riportato da Redwan et al.11, che utilizzava anch'esso la precipitazione per acidificazione e acido caprilico ma con un protocollo più complesso e laborioso. Questo metodo presenta anche vantaggi rispetto alle metodologie...

Tra le tecniche di immunodosaggio finalizzate alla diagnosi delle malattie, il test citometrico a microsfere è emerso come un approccio altamente sensibile e affidabile, poiché consente l'analisi di migliaia di particelle in un unico test1. Questa tecnica, oltre ad avere un'elevata produttività e a consentire l'utilizzo di volumi minori di campioni, presenta anche una grande flessibilità, poiché consente la rilevazione di diverse molecole, come citochine, molecole di adesione, isotipi di anticorpi e proteine 2,3.
Per lo sviluppo di questi saggi vengono utilizzate diverse particelle, tra cui le perle di lattice, che sono un input efficace e a basso costo. Questi possono presentare modificazioni sulla loro superficie, come la presenza di gruppi funzionali o proteine che permettono l'accoppiamento covalente o non covalente di alcune molecole 3,4,5.
Questi test immunologici utilizzano componenti come antigeni e anticorpi per eseguire il rilevamento di marcatori di malattia e richiedono comunemente anticorpi da mammiferi come topi, conigli e capre. Questo crea problemi legati a questioni etiche, poiché l'immunizzazione dei mammiferi richiede generalmente molti animali per ottenere una buona resa, nonché la frequente esecuzione di procedure che portano alla sofferenza degli animali 6,7. Un'alternativa a questo è l'uso di anticorpi IgY isolati dai tuorli d'uovo di polli immunizzati, poiché nei tuorli si possono trovare alte concentrazioni di anticorpi specifici contro gli antigeni inoculati; La produzione di un pollo equivale alla produzione di 4,3 conigli nel corso di un anno 6,7.
Pertanto, l'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un metodo per valutare gli anticorpi IgY ottenuti da tuorli d'uovo di gallina utilizzando la citometria a flusso con perline di lattice. Per questo, proponiamo un metodo di standardizzazione per un test immunologico citometrico a microsfere in formato sandwich utilizzando perle di lattice. Come modello, abbiamo utilizzato anticorpi IgY diretti contro l'antigene della proteina II ricca di istidina del Plasmodium falciparum (IgY-PfHRP2). Descriviamo un metodo per l'estrazione degli anticorpi, discutiamo i passaggi critici per definire la concentrazione di accoppiamento di questi alle perle di lattice e presentiamo una valutazione del limite di rilevazione dell'antigene. L'elevata precisione della citometria a flusso, unita al basso costo delle perle di lattice, rendono questa tecnica applicabile per l'analisi di strumenti di immunoanalisi, come anticorpi e antigeni. Questo metodo può essere utilizzato per il rilevamento di diversi obiettivi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF&#160;488A antibody produced in donkey</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#8242;)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BF-FACSC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T research beads (CS&#38;T research beads)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software 7.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloride 37% acid molecular grade</td>
			<td>NEON</td>
			<td>02618 NEON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML latex, 4% w/v</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-HM8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003335620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>P.10.0594.024.00.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>R09211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer Heat/Cool</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K80-120R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies

I dosaggi immunologici sono test importanti per l'individuazione di numerosi bersagli molecolari. Tra i metodi attualmente disponibili, il test citometrico a microsfere ha guadagnato importanza negli ultimi decenni. Ogni microsfera che viene letta dall'apparecchiatura rappresenta un evento di analisi della capacità di interazione tra le molecole in prova. Migliaia di questi eventi vengono letti in un unico saggio, garantendo così un'elevata precisione e riproducibilità del saggio. Questa metodologia può essere utilizzata anche nella validazione di nuovi input, come gli anticorpi IgY, per la diagnosi di malattie. Questi anticorpi si ottengono immunizzando i polli con l'antigene di interesse e quindi estraendo l'immunoglobulina dal tuorlo delle uova degli animali; Pertanto, questo è un metodo indolore e altamente produttivo per ottenere gli anticorpi. Oltre a una metodologia per la validazione ad alta precisione della capacità di riconoscimento degli anticorpi di questo test, questo documento presenta anche un metodo per estrarre questi anticorpi, determinare le migliori condizioni di accoppiamento per gli anticorpi e le perle di lattice e determinare la sensibilità del test.

La Figura 2 fornisce una rappresentazione grafica del processo di estrazione degli anticorpi IgY tramite acidificazione, seguita da separazione mediante acido caprilico (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> Figura 2: Rappresentazione schematica della fase di estrazione degli anticorpi IgY...

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Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

Questo protocollo descrive una metodologia per la preparazione di perle di lattice per saggi che utilizzano anticorpi IgY per la rilevazione dell'antigene.

Standardizzazione di un test citometrico a perline basato su anticorpi tuorlo d'uovo

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

Tra le tecniche di dosaggio immunologico volte a diagnosticare la malattia, il test citometrico a microsfere è emerso come un approccio altamente sensibile e affidabile, analizzando migliaia di particelle in un singolo test. L'elevata precisione della citometria a flusso, unita al basso costo delle perle di lattice, rendono la nostra tecnica applicabile per l'analisi di strumenti di immunodosaggio, come anticorpi e antigeni. Gli anticorpi IgY hanno un basso costo e vantaggi etici nella loro produzione e possono essere utilizzati come strumento di rilevamento per le malattie rare.Iniziare immergendo le uova appena deposte o di quattro giorni, del lignaggio bianco Gallus gallus deckle, in una soluzione diluita allo 0,2% di ipoclorito di sodio. Sciacquateli velocemente sotto l'acqua corrente e strofinateli delicatamente. Rompete con cura l'uovo, separate il tuorlo dall'albume con l'aiuto di un separatore di tuorli.E rimuovere il bianco in eccesso con carta da filtro. Forare il tuorlo e raccoglierne l'interno in un tubo conico da 50 millilitri. Conservare il tuorlo a meno 20 gradi Celsius per almeno 24 ore prima dell'uso.Dopo aver scongelato il tuorlo immagazzinato, diluirlo in un rapporto di uno a 10 in un PBS millimolare. Regolare il pH della soluzione a cinque, con un normale acido cloridrico, e incubare la soluzione a quattro gradi Celsius per 6-24 ore. Centrifugare la soluzione a 3000 G per 40 minuti e filtrare il surnatante recuperato utilizzando un filtro di cellulosa da 0,7 millimetri, prima di regolare nuovamente il pH del surnatante a cinque.Aggiungere l'acido caprilico a una concentrazione finale dell'8,7% sotto costante agitazione, per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver centrifugato i campioni per 15 minuti, separare il surnatante dal materiale precipitato. Regolare nuovamente il pH della soluzione a 7,4 utilizzando un molare di idrossido di sodio.E quantificare gli anticorpi usando il test di Bradford, prima di conservarli a meno 20 gradi Celsius. Aggiungi 21 microlitri di EDC e 21 microlitri di NHS a 21 microlitri di perline di lattice. E regolare a un volume finale di 2,1 millilitri, con PBS filtrato da 10 millimolari.Incubare la soluzione a 22 gradi Celsius, agitando rapidamente, per tre ore. Aggiungere l'anticorpo di cattura precedentemente estratto, IgY PfHRP2, a diverse microprovette contenenti 100 microlitri di questa soluzione. E incubare di nuovo per 16 ore.Dopo aver centrifugato i campioni e scartato i surnatanti, lavare due volte le perle di lattice con 500 microlitri di PBS filtrato da 10 millimolari, utilizzando cicli di centrifugazione e risonanza. Per il blocco delle perle, risospendere i campioni in un millilitro di tampone bloccante e seguire la stessa procedura mostrata in precedenza per incubarlo per due ore. Dopo aver lavato le perle con PBS, risuspenderle nuovamente in tampone PBS da 10 millimolari.Aggiungere 100 microlitri di anticorpo fluorescente anti-pollo, diluito a uno a 2000 in una miscela da 10 millimolari di PBS e BSA, in ciascuna microprovetta. Incubare i campioni al buio per 30 minuti. Dopo aver lavato le perle, risuspenderle nuovamente con 250 microlitri di PBS filtrato da 10 millimolari.Determinare il limite di rilevazione distribuendo 100 microlitri della preparazione di microsfere bloccate, in provette contenenti diverse quantità della proteina ricombinante diluita PfHRP2 in triplice copia. Incubare le soluzioni di microsfere con la proteina a 22 gradi Celsius, agitando rapidamente, per un'ora. Lavare le perle con 500 microlitri di PBS 10 millimolari filtrato, con centrifugazione, come precedentemente dimostrato.Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere due microgrammi di anticorpi IgG di topo contro la proteina ricombinante, diluiti in 10 millimolari PBS e BSA a ciascun campione, e seguire la stessa procedura per l'incubazione. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di anticorpo anti-topo fluorescente diluito a ciascun campione. Dopo l'incubazione, risospendere il campione in 250 microlitri di PBS filtrato da 10 millimolari.Accendere il computer e il citometro a flusso e attendere alcuni minuti affinché l'apparecchiatura si colleghi al computer. Fare clic sul software di citometria installato sul computer e accedere. Dall'area di lavoro del software, selezionare Citometro, Seguito da Avvio fluidico, Modalità di pulizia e SIT Flush.Definire la strategia di gating in base alle caratteristiche morfometriche e di fluorescenza della particella di controllo negativo. Per determinare la morfometria delle celle, scegliere il grafico del grafico del dot plot per l'analisi dei parametri della dispersione in avanti A utilizzando la dispersione laterale A.Determinare le singole celle in base alla dispersione laterale utilizzando il grafico del grafico del grafico del punto per l'analisi della dispersione laterale W sull'asse Y e della dispersione laterale H nell'asse X. E determinare le singole celle per dispersione in avanti, utilizzando il grafico del grafico a punti, per l'analisi della dispersione in avanti W sull'asse Y e della dispersione in avanti H nell'asse X.Per l'analisi della fluorescenza, scegliere i grafici a punti FL1 utilizzando la dispersione diretta A.Utilizzare un tubo di polistirene con tappo contenente campioni non etichettati e campioni precedentemente etichettati con Alexa Fluor 488 monocolore E mescolare con cura il contenuto del tubo. Collegare il tubo alla sonda del citometro a flusso e fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Acquisisci. Per impostare la potenza dei laser, fare clic su Parametri e, nelle opzioni seguenti, regolare la tensione della dispersione diretta a 182 volt e la tensione della dispersione laterale a 236 volt.Per impostare la soglia sul citometro, fare clic su Soglia e, nelle opzioni seguenti, regolare l'FSC a 500 volt. Impostare il gate di analisi per caratterizzare le particelle in base alle dimensioni e alla complessità, nonché per eseguire l'analisi di una singola cella. Rimuovere l'autofluorescenza analizzando il campione privo di coloranti contenente solo le perle di lattice e regolando la tensione del rivelatore FL1 FITC a 332 volt.Impostare il gate di analisi della fluorescenza in formato quadrangolare, dal punto negativo mostrato nel grafico del dot plot. Dopo aver regolato le analisi morfometriche e fluorescenti, configurare il dispositivo per 50.000 eventi e fare clic su Registra. Di seguito sono riportati i profili elettroforetici dell'anticorpo IgY PfHRP2, dovuto alla separazione mediante acido caprilico.Da questa figura si evince che gli anticorpi prima e dopo la separazione dell'acido caprilico hanno mostrato profili elettroforetici simili, con bande caratteristiche di 65 kilodalton e 27 kilodalton, che si riferiscono alle catene leggere e pesanti delle IgY. Oltre a queste, sono visibili anche altre bande, probabilmente dovute al precursore della proteina del tuorlo d'uovo del frammento terminale C, la vitellogenina II. La valutazione della concentrazione di saturazione degli anticorpi sulle perle di lattice è fondamentale per lo sviluppo di un test immunologico con le perle.Di seguito è riportata una curva della percentuale di fluorescenza di diverse concentrazioni di anticorpi, accoppiata a ciascun microlitro di perle di lattice commerciali utilizzate. All'aumentare della concentrazione, sono aumentati anche i valori percentuali e si sono stabilizzati a due microgrammi di concentrazione di anticorpi, stabilendo che è la concentrazione di accoppiamento ottimale per il test immunologico dell'antigene target. Il limite di rilevazione è stato determinato valutando la percentuale di fluorescenza della reattività alla velocità del lattice rispetto alle diverse concentrazioni della proteina rPfHRP2.Da un test immunologico a sandwich, è stato osservato che la fluorescenza è aumentata da 0,01 microgrammi di proteina PfHRP2 e si è stabilizzata a 0,1 microgrammi. Non c'è stata alcuna differenza significativa nella fluorescenza a zero microgrammi e 0,01 microgrammi. Tuttavia, è stata osservata una differenza significativa nella fluorescenza a 0,01 microgrammi, 0,1 microgrammi e 10 microgrammi.La fase di lavaggio di questo protocollo è fondamentale per evitare la perdita di perline. Il calibro deve essere ben definito in modo che non ci siano errori nel risultato ottenuto. I passaggi qui descritti rappresentano un'importante standardizzazione, necessaria per garantire l'affidabilità dei test diagnostici che utilizzano perle di lattice che vengono valutate tramite citometria completa.Pertanto, questa metodologia è un'alternativa ai classici modelli di test sandwich. Questo metodo può essere applicato a diversi tipi di saggi e può essere adatto per far fronte a diverse molecole sulla superficie delle microsfere, nonché per la rilevazione di diversi analiti.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

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Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Un saggio basato sull'elettrochemiluminescenza per le varianti proteiche MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Pinzette ottiche per studiare le interazioni RNA-proteina nella regolazione della traduzione

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Studi di interazioni Chaperone-Cochaperone utilizzando il saggio omogeneo basato su perle

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...