Name: standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies at JoVE.com

장학금을 제공해주신 FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), 생명공학 대학원 프로그램(PPGBIOTEC at the Universidade Federal do Amazonas - UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) 및 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM)에 장학금을 제공해주신 데 대해 감사드립니다. 그림 2와 그림 4는 biorender.com 로 만들어졌습니다.

알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 달걀 노른자에서 IgY 추출
<ol><li>계란의 위생<ol><li>달걀(갓 낳은 것 또는 낳은 후 4일까지, 갈루스 갈루스 데칼브 화이트 혈통에서)을 0.2% 희석된 차아염소산나트륨 용액에 담그고 흐르는 물에 빠르게 헹구고 나중에 또는 즉시 사용할 수 ?...

<ol>
	<li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies.">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).</li><li>de Figueiredo, A. M., Gl&#243;ria, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mari&#250;ba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry:+A+review.">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+bead-based+multiplexing.">The genesis and evolution of bead-based multiplexing.</a> Methods. 158, 2-11 (2019).</li><li>Kellar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microsphere-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays.</a> Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).</li><li>Schade, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+A+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins+in+the+control+of+terrestrial+and+aquatic+animal+diseases:+A+review.">Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review.</a> Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments.">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).</li><li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li><li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk.">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).</li><li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents.">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li><li>Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgY+Technology:+Extraction+of+chicken+antibodies+from+egg+yolk+by+polyethylene+glycol+(PEG)+precipitation.">IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).</li><li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides.">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li><li>Ko, K. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+immunoglobulin+Y+from+egg+yolk+using+ammonium+sulfate+precipitation+and+ion+exchange+chromatography.">Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.</a> Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+IgY+from+the+yolks+of+eggs+by+a+chloroform+polyethylene+glycol+procedure.">Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure.</a> Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).</li><li>Simonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xMAP-based+analysis+of+three+most+prevalent+staphylococcal+toxins+in+Staphylococcus+aureus+cultures.">xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+for+detection+of+staphylococcal+and+streptococcal+exotoxins.">A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins.</a> PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).</li><li>Merbah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+a+cytometric+p24-capture+bead-assay+for+the+detection+of+main+HIV-subtypes.">Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes.</a> Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).</li></ol>

pH 감소에 의한 IgY 항체의 침전 후 카프릴산을 이용한 지질 분리의 방법은 기능성 손실 없이 전체 항체를 분리하는데 효율적이다. 여기에서 제안된 방법은 Redwan et al.11에 의해 보고된 방법보다 간단하고 저렴하며, 산성화 및 카프릴산에 의한 침전도 사용했지만 더 복잡하고 힘든 프로토콜을 사용했습니다. 이 방법은 또한 PEG 침전 12,13, 황산나트륨 14,15 ?...

질병 진단을 목표로 하는 면역분석 기법 중에서, 세포측정 비드 분석법은 단일 분석법으로 수천 개의 입자를 분석할 수 있기 때문에 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 접근법으로 부상하고 있다1. 이 기술은 생산성이 높고 소량의 샘플을 사용할 수있을뿐만 아니라 사이토 카인, 접착 분자, 항체 이소 타입 및 단백질 2,3과 같은 여러 분자를 검출 할 수 있기 때문에 유연성이 뛰어납니다.
이러한 분석법의 개발에는 다양한 입자가 사용되며, 그 중 라텍스 비드는 효과적이고 저렴한 투입물입니다. 이들은 특정 분자의 공유 또는 비공유 결합을 허용하는 작용기 또는 단백질의 존재와 같은 표면에 변형을 나타낼 수 있습니다 3,4,5.
이러한 면역검정은 항원 및 항체와 같은 성분을 사용하여 질병 마커의 검출을 수행하며 일반적으로 생쥐, 토끼 및 염소와 같은 포유류의 항체를 필요로 합니다. 이것은 포유류의 예방 접종이 일반적으로 많은 동물들이 좋은 수확량을 얻을뿐만 아니라 동물의 고통을 초래하는 절차의 빈번한 수행을 요구하기 때문에 윤리적 문제와 관련된 문제를 야기한다 6,7. 이에 대한 대안은 접종 된 항원에 대한 고농도의 특정 항체가 노른자에서 발견 될 수 있기 때문에 면역 화 된 닭의 난황에서 분리 된 IgY 항체를 사용하는 것입니다. 닭의 생산은 6,7 년 동안 4.3 마리의 토끼를 생산하는 것과 같습니다.
따라서, 이 프로토콜의 목적은 라텍스 비드를 이용한 유세포 분석을 사용하여 닭고기 달걀 노른자로부터 수득된 IgY 항체를 평가하는 방법을 제공하는 것이다. 이를 위해 라텍스 비드를 이용한 샌드위치 형태의 세포측정 비드 면역분석법의 표준화 방법을 제안한다. 모델로서 우리는 Plasmodium falciparum 히스티딘이 풍부한 단백질 II 항원(IgY-Pf HRP2)에 대한 IgY 항체를 사용했습니다. 우리는 항체를 추출하는 방법을 설명하고, 라텍스 비드에 대한 이들의 결합 농도를 정의하기 위한 중요한 단계를 논의하고, 항원 검출 한계에 대한 평가를 제시합니다. 유세포 분석의 높은 정확도와 저렴한 라텍스 비드 비용으로 인해 이 기술은 항체 및 항원과 같은 면역분석 도구의 분석에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 표적을 탐지하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF&#160;488A antibody produced in donkey</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#8242;)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BF-FACSC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T research beads (CS&#38;T research beads)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software 7.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloride 37% acid molecular grade</td>
			<td>NEON</td>
			<td>02618 NEON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML latex, 4% w/v</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-HM8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003335620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>P.10.0594.024.00.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>R09211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer Heat/Cool</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K80-120R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies

면역 측정법은 수많은 분자 표적의 검출을위한 중요한 검사입니다. 현재 사용 가능한 방법 중에서 세포 측정 비드 분석은 최근 수십 년 동안 두각을 나타내고 있습니다. 장비에서 판독하는 각 마이크로스피어는 테스트 중인 분자 간의 상호 작용 용량에 대한 분석 이벤트를 나타냅니다. 이러한 수천 개의 이벤트가 단일 분석에서 판독되므로 높은 분석 정확도와 재현성이 보장됩니다. 이 방법론은 질병 진단을 위한 IgY 항체와 같은 새로운 투입물의 검증에도 사용할 수 있습니다. 이 항체는 관심 항원으로 닭을 면역시킨 다음 동물 알의 노른자에서 면역 글로불린을 추출하여 얻습니다. 따라서 이것은 항체를 얻기위한 고통이없고 매우 생산적인 방법입니다. 이 분석법의 항체 인식 능력에 대한 고정밀 검증을 위한 방법론 외에도 이 논문은 이러한 항체를 추출하고, 항체와 라텍스 비드에 대한 최상의 결합 조건을 결정하고, 검사의 민감도를 결정하는 방법을 제시합니다.

그림 2는 산성화를 통한 IgY 항체의 추출 과정과 카프릴산을 사용한 분리를 그래픽으로 보여줍니다(그림 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> 그림 2: IgY 항체의 추출 단계 및 카프릴산을 사용한 분리의 개략도 . (A) ?...

Watch this Scientific Journal Video about Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies at JoVE.com

Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

이 프로토콜은 항원 검출을 위해 IgY 항체를 사용하여 분석용 라텍스 비드를 제조하는 방법론을 설명합니다.

달걀 노른자 항체를 기반으로 한 세포 측정 비드 분석의 표준화

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

질병 진단을 목표로 하는 면역분석 기술 중 세포측정 비드 분석은 단일 분석에서 수천 개의 입자를 분석하는 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 접근 방식으로 부상했습니다. 유세포 분석의 높은 정확도와 저렴한 라텍스 비드의 저렴한 비용으로 인해 당사의 기술은 항체 및 항원과 같은 면역 분석 도구의 분석에 적용할 수 있습니다. IgY 항체는 저비용, 이의 생산에 있어서 윤리적 이점을 가지며, 희귀 질환에 대한 검출 도구로서 사용될 수 있다.Gallus gallus deckle 흰색 혈통에서 갓 낳은 알이나 4일 된 알을 0.2% 희석된 차아염소산나트륨 용액에 담그는 것으로 시작합니다. 흐르는 물에 빠르게 헹구고 부드럽게 닦으십시오. 계란을 조심스럽게 깨고 노른자 분리기를 사용하여 노른자를 흰색에서 분리하십시오.그리고 여과지로 여분의 흰색을 제거하십시오. 노른자를 뚫고 내부를 50 밀리리터의 원추형 튜브에 모으십시오. 사용하기 전에 최소 20시간 동안 노른자를 섭씨 영하 24도에서 보관하십시오.저장된 노른자를 해동한 후 1밀리몰 PBS에 1:10 비율로 희석합니다. 용액의 pH를 1 개의 일반 염산으로 5로 조정하고 섭씨 4도에서 6 내지 24 시간 동안 용액을 배양한다. 용액을 3000 G에서 40분 동안 원심분리하고, 상청액의 pH를 5로 재조정하기 전에 0.7 밀리미터 셀룰로오스 필터를 사용하여 회수된 상청액을 여과한다.섭씨 4도에서 30 분 동안 일정한 교반하에 8.7 %의 최종 농도에 카 프릴 산을 첨가한다. 샘플을 15분 동안 원심분리한 후, 침전된 물질로부터 상청액을 분리한다. 1몰 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 7.4로 재조정합니다.섭씨 영하 20도에서 보관하기 전에 Bradford assay를 사용하여 항체를 정량화합니다. 21 마이크로 리터의 EDC와 21 마이크로 리터의 NHS를 21 마이크로 리터의 라텍스 비드에 첨가하십시오. 그리고 여과된 10밀리몰 PBS를 사용하여 2.1밀리리터의 최종 부피로 조정합니다.용액을 섭씨 22도에서 3 시간 동안 빠르게 흔들면서 배양합니다. 이전에 추출한 포획 항체인 IgY PfHRP2를 이 용액 100마이크로리터가 들어 있는 다른 마이크로 튜브에 추가합니다. 그리고 16 시간 동안 다시 배양하십시오.샘플을 원심분리하고 상청액을 버린 후, 원심분리 및 재현탁 사이클을 사용하여 여과된 10밀리몰 PBS 500마이크로리터로 라텍스 비드를 2회 세척합니다. 비드의 블로킹을 위해, 샘플을 1밀리리터의 블로킹 완충액에 재현탁하고, 이전에 나타낸 것과 동일한 절차에 따라 2시간 동안 인큐베이션한다. 비드를 PBS로 세척한 후, 10 밀리몰 PBS 완충액에 다시 재현탁시킨다.PBS와 BSA의 10 밀리몰 혼합물에서 1 내지 2000으로 희석 된 100 마이크로 리터의 형광 항 닭 항체를 각 마이크로 튜브에 첨가한다. 샘플을 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 비드를 세척한 후, 250 마이크로리터의 여과된 10 밀리몰 PBS로 이들을 다시 현탁시킨다.100 마이크로리터의 차단된 비드 제제를 서로 다른 양의 희석된 재조합 단백질 PfHRP2를 세 배로 함유하는 튜브에 분배하여 검출 한계를 결정합니다. 단백질과 함께 비드 용액을 섭씨 22도에서 빠르게 진탕하면서 1시간 동안 배양합니다. 이전에 입증된 바와 같이, 원심분리를 이용하여, 여과된 10 밀리몰 PBS의 500 마이크로리터로 비드를 세척한다.상청액을 버린 후 재조합 단백질에 대해 2 마이크로 그램의 마우스 IgG 항체를 각 샘플에 10 밀리몰 PBS 및 BSA로 희석하고 동일한 배양 절차를 따르십시오. 다음으로, 희석된 형광 항-마우스 항체 100 마이크로리터를 각 샘플에 첨가한다. 인큐베이션 후, 샘플을 250 마이크로리터의 여과된 10 밀리몰 PBS에 재현탁시킨다.컴퓨터와 유세포 분석기를 켜고 장비가 컴퓨터에 연결될 때까지 몇 분 정도 기다립니다. 컴퓨터에 설치된 세포 분석 소프트웨어를 클릭하고 로그인하십시오. 소프트웨어 작업 공간에서 Cytometer(유세포분석기)를 선택한 다음 Fluidics Startup(유체 시작), Cleaning Modes(세척 모드) 및 SIT Flush(SIT 플러시)를 선택합니다.음성 대조 입자의 형태 측정 및 형광 특성을 기반으로 게이팅 전략을 정의합니다. 세포 형태 측정을 결정하려면 측면 산란 A를 사용하여 전방 산란 A 파라미터를 분석하기 위해 도트 플롯 플롯 그래픽을 선택합니다.Y축의 측면 산란 W와 X축의 측면 산란 H를 분석하기 위해 도트 플롯 플롯 그래픽을 사용하여 측면 산란으로 단일 셀을 결정합니다. 그리고 Y축의 전방 산란 W와 X축의 전방 산란 H를 분석하기 위해 도트 플롯 플롯 그래픽을 사용하여 전방 산란으로 단일 세포를 결정합니다.형광 분석의 경우, 전방 산란을 사용하여 FL1 도트 플롯 플롯을 선택합니다. A.표지되지 않은 샘플, 및 이전에 단색 Alexa Fluor 488로 표지된 샘플을 포함하는 스토퍼된 폴리스티렌 튜브를 사용하고 튜브의 내용물을 조심스럽게 혼합합니다. 튜브를 유세포 분석기 프로브에 부착하고 Acquire(획득)를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 레이저의 출력을 설정하려면 매개 변수를 클릭하고 아래 옵션에서 순방향 산란의 전압을 182 볼트로, 측면 산란의 전압을 236 볼트로 조정하십시오.세포분석기의 임계값을 설정하려면 임계값을 클릭하고 아래 옵션에서 FSC를 500볼트로 조정합니다. 분석 게이트를 설정하여 크기 및 복잡성에 따라 입자를 특성화하고 단일 세포 분석을 수행합니다. 라텍스 비드만을 함유하는 무색소 시료를 분석하여 자가형광을 제거하고, 검출기 FL1 FITC의 전압을 332 볼트로 조절하였다.형광 분석 게이트를 도트 플롯 그래프에 표시된 음의 점에서 사각형 형식으로 설정합니다. 형태 측정 및 형광 분석이 조정 된 후 50, 000 이벤트에 대해 장치를 구성하고 기록을 클릭하십시오. 카프릴산을 사용한 분리로 인한 IgY PfHRP2 항체의 전기영동 프로파일이 여기에 나와 있습니다.이 그림으로부터, 카 프릴 산 분리 전후의 항체는 IgY의 경쇄 및 중쇄를 나타내는 65 킬로 달톤 및 27 킬로 달톤의 특징적인 밴드와 함께 유사한 전기 영동 프로파일을 나타냄을 알 수있다. 이 외에도 C 말단 단편 난황 단백질 vitellogenin II 전구체로 인해 다른 밴드도 볼 수 있습니다. 라텍스 비드에 대한 항체 포화 농도를 평가하는 것은 비드로 면역분석을 개발하는 데 매우 중요합니다.사용된 상업용 라텍스 비드의 각 마이크로리터에 결합된 상이한 농도의 항체의 형광 백분율의 곡선이 여기에 나와 있습니다. 농도가 증가함에 따라 백분율 값도 증가하고 2마이크로그램의 항체 농도에서 안정되어 표적 항원 면역분석에 대한 최적의 결합 농도로 확립되었습니다. 검출 한계는 다양한 rPfHRP2 단백질 농도에 대한 라텍스 속도 반응성의 형광 백분율을 평가하여 결정되었습니다.샌드위치 면역검정으로부터, 형광이 0.01 마이크로그램의 PfHRP2 단백질로부터 증가하고, 0.1 마이크로그램에서 정체되는 것이 관찰되었다. 0마이크로그램과 0.01마이크로그램에서 형광에는 유의미한 차이가 없었습니다. 그러나, 형광의 유의한 차이는 0.01 마이크로그램, 0.1 마이크로그램 및 10 마이크로그램에서 관찰되었다.이 프로토콜의 세척 단계는 비드의 손실을 방지하는 데 중요합니다. 얻은 결과에 실수가 없도록 게이지를 잘 정의해야 합니다. 여기에 설명된 단계는 전체 세포분석을 통해 평가되는 라텍스 비드를 사용한 진단 테스트의 신뢰성을 보장하는 데 필요한 중요한 표준화를 나타냅니다.따라서이 방법론은 고전적인 샌드위치 테스트 모델의 대안입니다. 이 방법은 다양한 유형의 분석에 적용될 수 있으며 여러 분자를 비드 표면에 대처하고 다양한 분석물을 검출하는 데 적합할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

PRESTO-탱고 분석기를 사용하여 GPCR 전체 규모의 리간드 스크리닝을 위한 β-Arrestin2 모집의 병렬 심문

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

세포 기반 에스트로겐 수용체를 사용하여 식물에스트로겐에 대한 검사 β 리포터 분석

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

번역 조절에서 RNA 단백질 상호 작용을 연구하는 광학 핀셋

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

동질적인 구드 기반 분석체를 사용하여 샤페론 - 코카페론 상호 작용의 연구

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...