Name: standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00
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Ao Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBIOTEC) da Universidade Federal do Amazonas (UFAM), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela concessão das bolsas. A Figura 2 e a Figura 4 foram criadas com biorender.com.

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Extração de IgY de gemas de ovo
<ol><li>Higienização dos ovos<ol><li>Mergulhe os ovos (recém-postos ou até 4 dias após a colocação, da linhagem Gallus gallus Dekalb White) em uma solução diluída a 0,2% de hipoclorito de sódio, enxágue rapidamente em água corrente e limpe suavemente para uso po...

<ol>
	<li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies.">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).</li><li>de Figueiredo, A. M., Gl&#243;ria, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mari&#250;ba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry:+A+review.">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+bead-based+multiplexing.">The genesis and evolution of bead-based multiplexing.</a> Methods. 158, 2-11 (2019).</li><li>Kellar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microsphere-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays.</a> Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).</li><li>Schade, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+A+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins+in+the+control+of+terrestrial+and+aquatic+animal+diseases:+A+review.">Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review.</a> Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments.">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).</li><li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li><li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk.">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).</li><li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents.">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li><li>Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgY+Technology:+Extraction+of+chicken+antibodies+from+egg+yolk+by+polyethylene+glycol+(PEG)+precipitation.">IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).</li><li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides.">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li><li>Ko, K. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+immunoglobulin+Y+from+egg+yolk+using+ammonium+sulfate+precipitation+and+ion+exchange+chromatography.">Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.</a> Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+IgY+from+the+yolks+of+eggs+by+a+chloroform+polyethylene+glycol+procedure.">Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure.</a> Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).</li><li>Simonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xMAP-based+analysis+of+three+most+prevalent+staphylococcal+toxins+in+Staphylococcus+aureus+cultures.">xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+for+detection+of+staphylococcal+and+streptococcal+exotoxins.">A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins.</a> PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).</li><li>Merbah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+a+cytometric+p24-capture+bead-assay+for+the+detection+of+main+HIV-subtypes.">Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes.</a> Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).</li></ol>

O método de precipitação do anticorpo IgY por redução de pH seguida de separação lipídica utilizando ácido caprílico é eficiente no isolamento de anticorpos totais sem perda de funcionalidade. O método aqui proposto é mais simples e barato do que o relatado por Redwan et al.11, que também utilizaram precipitação por acidificação e ácido caprílico, porém com um protocolo mais complexo e trabalhoso. Esse método também apresenta vantagens sobre as metodologias comumente utiliza...

Dentre as técnicas de imunoensaio voltadas para o diagnóstico de doenças, o ensaio citométrico de contas tem emergido como uma abordagem altamente sensível e confiável, pois permite a análise de milhares de partículas em um único ensaio1. Essa técnica, além de apresentar alta produtividade e permitir a utilização de menores volumes de amostras, também apresenta grande flexibilidade, pois permite a detecção de diversas moléculas, como citocinas, moléculas de adesão, isotipos de anticorpos eproteínas2,3.
Diferentes partículas são utilizadas para o desenvolvimento desses ensaios, entre elas esferas de látex, que são um insumo eficaz e de baixo custo. Estas podem apresentar modificações em sua superfície, como a presença de grupos funcionais ou proteínas que permitem o acoplamento covalente ou não covalente de determinadas moléculas 3,4,5.
Esses imunoensaios usam componentes como antígenos e anticorpos para realizar a detecção de marcadores de doenças e comumente requerem anticorpos de mamíferos como camundongos, coelhos e cabras. Isso gera problemas relacionados a questões éticas, uma vez que a imunização de mamíferos geralmente requer muitos animais para obter um bom rendimento, bem como a realização frequente de procedimentos que levam ao sofrimento dos animais 6,7. Uma alternativa a isso é o uso de anticorpos IgY isolados das gemas de ovos de galinhas imunizadas, uma vez que altas concentrações dos anticorpos específicos contra os antígenos inoculados podem ser encontradas nas gemas; A produção de um frango equivale à produção de 4,3 coelhos ao longo de um ano 6,7.
Assim, o objetivo deste protocolo é fornecer um método para avaliar anticorpos IgY obtidos de gemas de ovo de galinha usando citometria de fluxo com esferas de látex. Para isso, propomos um método de padronização para um imunoensaio citométrico de esferas em formato sanduíche utilizando esferas de látex. Como modelo, foram utilizados anticorpos IgY direcionados ao antígeno II da proteína II rica em histidina do Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2). Descrevemos um método para extração dos anticorpos, discutimos os passos críticos para a definição da concentração de acoplamento destes aos cordões de látex e apresentamos uma avaliação do limite de detecção do antígeno. A alta acurácia da citometria de fluxo, aliada ao baixo custo das esferas de látex, tornam esta técnica aplicável para a análise de ferramentas de imunoensaio, como anticorpos e antígenos. Este método pode ser utilizado para a detecção de diversos alvos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF&#160;488A antibody produced in donkey</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#8242;)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BF-FACSC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T research beads (CS&#38;T research beads)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software 7.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloride 37% acid molecular grade</td>
			<td>NEON</td>
			<td>02618 NEON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML latex, 4% w/v</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-HM8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003335620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>P.10.0594.024.00.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>R09211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer Heat/Cool</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K80-120R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies

Os imunoensaios são testes importantes para a detecção de inúmeros alvos moleculares. Dentre os métodos atualmente disponíveis, o ensaio citométrico de contas tem ganhado destaque nas últimas décadas. Cada microesfera lida pelo equipamento representa um evento de análise da capacidade de interação entre as moléculas em teste. Milhares desses eventos são lidos em um único ensaio, garantindo alta precisão e reprodutibilidade do ensaio. Essa metodologia também pode ser utilizada na validação de novos insumos, como anticorpos IgY, para o diagnóstico de doenças. Esses anticorpos são obtidos através da imunização das galinhas com o antígeno de interesse e, em seguida, da extração da imunoglobulina da gema dos ovos dos animais; Portanto, este é um método indolor e altamente produtivo para a obtenção dos anticorpos. Além de uma metodologia para a validação de alta precisão da capacidade de reconhecimento de anticorpos deste ensaio, este trabalho também apresenta um método para extração desses anticorpos, determinação das melhores condições de acoplamento para os anticorpos e esferas de látex e determinação da sensibilidade do teste.

A Figura 2 fornece uma representação gráfica do processo de extração dos anticorpos IgY via acidificação, seguido de separação com ácido caprílico (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> Figura 2: Representação esquemática da etapa de extração dos anticorpos IgY e separaçã...

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Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

Este protocolo descreve uma metodologia para a preparação de esferas de látex para ensaios utilizando anticorpos IgY para detecção de antígenos.

Padronização de um ensaio citométrico de esferas baseado em anticorpos contra gema de ovo

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

Dentre as técnicas de imunoensaio voltadas para o diagnóstico de doenças, o ensaio citométrico de contas emergiu como uma abordagem altamente sensível e confiável, analisando milhares de partículas em um único ensaio. A alta acurácia da citometria de fluxo, aliada ao baixo custo das esferas de látex, tornam nossa técnica aplicável para a análise de ferramentas de imunoensaios, como anticorpos e antígenos. Os anticorpos IgY têm baixo custo e vantagens éticas em sua produção, podendo ser utilizados como ferramenta de detecção de doenças raras.Comece mergulhando os ovos recém-postos ou de quatro dias de idade, da linhagem branca Gallus gallus deckle, em uma solução diluída a 0,2% de hipoclorito de sódio. Enxágue-os rapidamente em água corrente e limpe suavemente. Quebre o ovo com cuidado, separe a gema da clara com a ajuda de um separador de gema.E retire o excesso de branco com papel filtro. Perfure a gema e colete seu interior em um tubo cônico de 50 mililitros. Guarde a gema a menos 20 graus Celsius durante pelo menos 24 horas antes da utilização.Após descongelar a gema armazenada, dilua-a na proporção de um para 10 em PBS milimolar. Ajustar o pH da solução a cinco, com um ácido clorídrico normal, e incubar a solução a quatro graus Celsius durante seis a 24 horas. Centrifugar a solução a 3000 G durante 40 minutos e filtrar o sobrenadante recuperado utilizando um filtro de celulose 0,7 milímetros, antes de reajustar o pH do sobrenadante para cinco.Adicionar ácido caprílico a uma concentração final de 8,7% sob agitação constante, durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugar as amostras por 15 minutos, separar o sobrenadante do material precipitado. Reajustar o pH da solução para 7,4 utilizando hidróxido de sódio molar.E quantificar os anticorpos usando o ensaio de Bradford, antes de armazená-los a 20 graus Celsius negativos. Adicione 21 microlitros de EDC, e 21 microlitros de NHS, a 21 microlitros de contas de látex. E ajustar para um volume final de 2,1 mililitros, com PBS filtrado de 10 milimolares.Incubar a solução a 22 graus Celsius, com agitação rápida, durante três horas. Adicionar o anticorpo de captura previamente extraído, IgY PfHRP2, a diferentes microtubos contendo 100 microlitros desta solução. E incubar novamente por 16 horas.Após centrifugar as amostras e descartar os sobrenadantes, lavar duas vezes as esferas de látex com 500 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares, utilizando ciclos de centrifugação e ressuspensão. Para o bloqueio das contas, ressuspenda as amostras em um mililitro de tampão de bloqueio e siga o mesmo procedimento mostrado anteriormente para incubá-las por duas horas. Depois de lavar as contas com PBS, ressuspendê-las novamente em tampão PBS de 10 milimolares.Adicionar 100 microlitros de anticorpo anti-frango fluorescente, diluídos de um a 2000 em mistura de 10 milimolares de PBS e BSA, a cada microtubo. Incubar as amostras no escuro por 30 minutos. Depois de lavar as contas, ressuspendê-las novamente com 250 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares.Determinar o limite de detecção distribuindo 100 microlitros da preparação de contas bloqueadas, em tubos contendo diferentes quantidades da proteína recombinante diluída PfHRP2 em triplicata. Incubar as soluções de esferas com a proteína a 22 graus Celsius, com agitação rápida, durante uma hora. Lavar as esferas com 500 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares, com centrifugação, conforme demonstrado anteriormente.Após o descarte do sobrenadante, adicionar dois microgramas de anticorpo IgG de camundongo contra a proteína recombinante, diluídos em PBS e BSA de 10 milimolares para cada amostra, e seguir o mesmo procedimento de incubação. Em seguida, adicione 100 microlitros do anticorpo anti-camundongo fluorescente diluído a cada amostra. Após a incubação, ressuspender a amostra em 250 microlitros de PBS filtrado de 10 milimolares.Ligue o computador e o citômetro de fluxo e aguarde alguns minutos para que o equipamento se conecte ao computador. Clique no software de citometria instalado no computador e faça login nele. No espaço de trabalho do software, selecione Citômetro, Seguido por Inicialização de Fluidics, Modos de Limpeza e SIT Flush.Definir a estratégia de gating com base nas características morfométricas e de fluorescência da partícula de controle negativo. Para determinar a morfometria celular, escolha o gráfico dot plot plot para a análise dos parâmetros de dispersão frontal A usando a dispersão lateral A.Determine as células únicas por dispersão lateral usando o gráfico dot plot plot para a análise da dispersão lateral W no eixo Y e da dispersão lateral H no eixo X. E determinar as células individuais por dispersão direta, usando gráfico de gráfico de gráfico de pontos, para a análise da dispersão direta W no eixo Y e da dispersão H no eixo X.Para a análise de fluorescência, escolha gráficos de pontos FL1 usando dispersão direta A.Use um tubo de poliestireno com tampa contendo amostras não rotuladas e amostras previamente rotuladas com Alexa Fluor 488 de cor única E misture cuidadosamente o conteúdo do tubo. Conecte o tubo à sonda do citômetro de fluxo e clique com o botão esquerdo em Adquirir. Para definir a potência dos lasers, clique em Parâmetros, e nas opções abaixo, ajuste a tensão do espalhamento para frente para 182 volts, e a tensão do espalhamento lateral para 236 volts.Para definir o limite no citômetro, clique em Threshold, e nas opções abaixo, ajuste o FSC para 500 volts. Defina a porta de análise para caracterizar partículas por tamanho e complexidade, bem como para realizar análises de célula única. Remova a autofluorescência analisando a amostra sem corante contendo apenas as esferas de látex e ajustando a tensão do detector FL1 FITC para 332 volts.Defina a porta de análise de fluorescência em formato quadrangular, a partir do ponto negativo mostrado no gráfico de gráfico de pontos. Após o ajuste das análises morfométricas e fluorescentes, configure o dispositivo para 50.000 eventos e clique em Registrar. Os perfis eletroforéticos do anticorpo IgY PfHRP2, devido à separação usando ácido caprílico, são mostrados aqui.A partir dessa figura, pode-se observar que os anticorpos antes e após a separação do ácido caprílico apresentaram perfis eletroforéticos semelhantes, com bandas características de 65 quilodaltons e 27 quilodaltons, que remetem às cadeias leve e pesada da IgY. Além dessas, outras bandas também são visíveis, provavelmente devido ao fragmento C terminal da proteína vitelogenina II precursora da vitelogenina II. A avaliação da concentração de saturação de anticorpos em esferas de látex é vital para o desenvolvimento de um imunoensaio com as contas.Uma curva da porcentagem de fluorescência de diferentes concentrações de anticorpos, acoplada a cada microlitro de esferas comerciais de látex utilizadas, é mostrada aqui. À medida que a concentração aumentou, os valores percentuais também aumentaram, e estabilizaram em dois microgramas de concentração de anticorpos, estabelecendo-a como a concentração de acoplamento ideal para o imunoensaio do antígeno alvo. O limite de detecção foi determinado avaliando-se a porcentagem de fluorescência da velocidade de reatividade ao látex contra diferentes concentrações da proteína rPfHRP2.A partir de um imunoensaio sanduíche, observou-se que a fluorescência foi aumentada a partir de 0,01 microgramas da proteína PfHRP2 e platô em 0,1 microgramas. Não houve diferença significativa na fluorescência a zero microgramas e 0,01 microgramas. No entanto, uma diferença significativa na fluorescência foi observada em 0,01 microgramas, 0,1 microgramas e 10 microgramas.A etapa de lavagem desse protocolo é fundamental para evitar a perda de miçangas. A bitola deve ser bem definida para que não haja erros no resultado obtido. As etapas aqui descritas representam uma importante padronização, necessária para garantir a confiabilidade dos testes diagnósticos utilizando esferas de látex que são avaliadas por citometria completa.Portanto, esta metodologia é uma alternativa aos modelos clássicos de teste sanduíche. Este método pode ser aplicado a diversos tipos de ensaios, podendo ser adequado para o enfrentamento de várias moléculas na superfície das contas, bem como para a detecção de diferentes analitos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Um ensaio baseado em fluorescência de Fosfolípido scramblase Atividade

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Bioquímica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Interrogatório paralelo de β-Arrestin2 Recrutamento para Triagem de Ligand em escala GPCR usando ensaio PRESTO-Tango

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Triagem para Fitoestrogênios usando um receptor de estrogênio baseado em células β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína MeCP2

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Pinças ópticas para estudar interações RNA-proteína no regulamento de tradução

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Estudos de Interações Acompanhante-Cochaperone usando ensaio homogêneo baseado em contas

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...