Name: standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies at JoVE.com

FIOCRUZ'a ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), Biyoteknoloji Yüksek Lisans Programı'na (Universidade Federal do Amazonas'ta PPGBIOTEC - UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) ve Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas'a (FAPEAM) burs sağladıkları için. Şekil 2 ve Şekil 4 biorender.com ile oluşturulmuştur.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Yumurta sarısından IgY ekstraksiyonu
<ol><li>Yumurtaların hijyenizasyonu<ol><li>Yumurtaları (taze bırakılmış veya yumurtlamadan 4 gün sonrasına kadar, Gallus gallus Dekalb White soyundan gelene kadar) %0.2 seyreltilmiş sodyum hipoklorit çözeltisine daldırın, akan su altında hızlıca durulayın ve daha sonra ...

<ol>
	<li>Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+the+diagnosis+and+follow+up+of+human+primary+immunodeficiencies.">Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies.</a> Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).</li><li>de Figueiredo, A. M., Gl&#243;ria, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mari&#250;ba, L. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+applications+of+microsphere-based+flow+cytometry:+A+review.">Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review.</a> Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).</li><li>Morgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometric+bead+array:+A+multiplexed+assay+platform+with+applications+in+various+areas+of+biology.">Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology.</a> Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).</li><li>Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+bead-based+multiplexing.">The genesis and evolution of bead-based multiplexing.</a> Methods. 158, 2-11 (2019).</li><li>Kellar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microsphere-based+flow+cytometric+assays.">Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays.</a> Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).</li><li>Schade, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+egg+yolk+antibodies+(IgY-technology):+A+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine.">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins+in+the+control+of+terrestrial+and+aquatic+animal+diseases:+A+review.">Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review.</a> Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Sousa, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polyclonal+antibody-based+sandwich+ELISA+for+detection+of+Plasmodium+vivax+developed+from+two+lactate+dehydrogenase+protein+segments.">A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).</li><li>Klimentzou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha.">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).</li><li>Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+protocol+for+immunoglobulin+Y+purification+from+chicken+egg+yolk.">Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk.</a> Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).</li><li>Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+separation+of+immunoglobulin+Y+and+phosvitin+from+chicken+egg+yolk+without+using+organic+solvents.">Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents.</a> Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).</li><li>Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgY+Technology:+Extraction+of+chicken+antibodies+from+egg+yolk+by+polyethylene+glycol+(PEG)+precipitation.">IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).</li><li>Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+immunoglobulin+from+egg+yolk+by+anionic+polysaccharides.">Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).</li><li>Ko, K. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+immunoglobulin+Y+from+egg+yolk+using+ammonium+sulfate+precipitation+and+ion+exchange+chromatography.">Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography.</a> Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).</li><li>Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+IgY+from+the+yolks+of+eggs+by+a+chloroform+polyethylene+glycol+procedure.">Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure.</a> Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).</li><li>Simonova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=xMAP-based+analysis+of+three+most+prevalent+staphylococcal+toxins+in+Staphylococcus+aureus+cultures.">xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).</li><li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+for+detection+of+staphylococcal+and+streptococcal+exotoxins.">A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins.</a> PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).</li><li>Merbah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+a+cytometric+p24-capture+bead-assay+for+the+detection+of+main+HIV-subtypes.">Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes.</a> Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).</li></ol>

IgY antikorunun pH redüksiyonu ve ardından kaprilik asit kullanılarak lipid ayrımı ile çökeltilmesi yöntemi, işlevsellikte herhangi bir kayıp olmadan toplam antikorların izole edilmesinde etkilidir. Burada önerilen yöntem, asitleştirme ve kaprilik asit ile çökeltmeyi de kullanan, ancak daha karmaşık ve zahmetli bir protokole sahip olan Redwan ve ark.11 tarafından bildirilenden daha basit ve daha ucuzdur. Bu yöntem aynı zamanda, diğerlerinin yanı sıra PEG çökeltme 12,13, s...

Hastalıkların teşhisine yönelik immünoassay teknikleri arasında sitometrik boncuk testi, tek bir tahlilde binlerce partikülün analizine izin verdiği için oldukça hassas ve güvenilir bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır1. Bu teknik, yüksek üretkenliğe sahip olmasının ve daha küçük hacimli numunelerin kullanımına izin vermesinin yanı sıra, sitokinler, adezyon molekülleri, antikor izotipleri ve proteinler gibi çeşitli moleküllerin saptanmasına izin verdiği için büyük esneklik de sunar 2,3.
Bu tahlillerin geliştirilmesi için farklı partiküller kullanılır, bunların arasında etkili ve düşük maliyetli bir girdi olan lateks boncuklar da vardır. Bunlar, belirli moleküllerin 3,4,5 kovalent veya kovalent olmayan bağlanmasına izin veren fonksiyonel grupların veya proteinlerin varlığı gibi yüzeylerinde değişiklikler sunabilir.
Bu immünolojik testler, hastalık belirteçlerinin tespitini gerçekleştirmek için antijenler ve antikorlar gibi bileşenleri kullanır ve genellikle fareler, tavşanlar ve keçiler gibi memelilerden antikorlar gerektirir. Bu, etik konularla ilgili sorunlar yaratır, çünkü memelilerin aşılanması genellikle birçok hayvanın iyi bir verim elde etmesini ve hayvanların acı çekmesine yol açan prosedürlerin sık sık uygulanmasını gerektirir 6,7. Buna bir alternatif, aşılanmış tavukların yumurta sarısından izole edilen IgY antikorlarının kullanılmasıdır, çünkü aşılanmış antijenlere karşı spesifik antikorların yüksek konsantrasyonları yumurta sarısında bulunabilir; Bir tavuğun üretimi, bir yıl boyunca 4.3 tavşan üretimineeşdeğerdir 6,7.
Bu nedenle, bu protokolün amacı, lateks boncuklu akış sitometrisi kullanılarak tavuk yumurtası sarısından elde edilen IgY antikorlarının değerlendirilmesi için bir yöntem sağlamaktır. Bunun için, lateks boncuklar kullanılarak sandviç formatında bir sitometrik boncuk immünolojik testi için bir standardizasyon yöntemi öneriyoruz. Model olarak, Plasmodium falciparum histidin açısından zengin protein II antijenine (IgY-PfHRP2) yönlendirilmiş IgY antikorları kullanıldı. Antikorların ekstraksiyonu için bir yöntem açıklıyoruz, bunların lateks boncuklara bağlanma konsantrasyonunu tanımlamak için kritik adımları tartışıyoruz ve antijenin tespit sınırının bir değerlendirmesini sunuyoruz. Akış sitometrisinin yüksek doğruluğu, lateks boncukların düşük maliyeti ile birleştiğinde, bu tekniği antikorlar ve antijenler gibi immünoassay araçlarının analizi için uygulanabilir kılar. Bu yöntem, çeşitli hedeflerin tespiti için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF&#160;488A antibody produced in donkey</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#8242;)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4600388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BF-FACSC2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva CS&#38;T research beads (CS&#38;T research beads)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva software 7.0</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>655677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprilic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloride 37% acid molecular grade</td>
			<td>NEON</td>
			<td>02618 NEON</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CML latex, 4% w/v</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C37253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megafuge 8R</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TS-HM8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7750-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1003335620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>P.10.0594.024.00.27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Acs Cientifica</td>
			<td>R09211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Mixer Heat/Cool</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K80-120R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardization of a cytometric bead assay based on egg-yolk antibodies

İmmünoanalizler, çok sayıda moleküler hedefin tespiti için önemli testlerdir. Şu anda mevcut olan yöntemler arasında, sitometrik boncuk testi son yıllarda önem kazanmıştır. Ekipman tarafından okunan her mikroküre, test edilen moleküller arasındaki etkileşim kapasitesinin bir analiz olayını temsil eder. Bu olayların binlercesi tek bir tahlilde okunur, böylece yüksek tahlil doğruluğu ve tekrarlanabilirlik sağlanır. Bu metodoloji, hastalıkların teşhisi için IgY antikorları gibi yeni girdilerin doğrulanmasında da kullanılabilir. Bu antikorlar, tavukların ilgilenilen antijen ile aşılanması ve daha sonra hayvanların yumurta sarısından immünoglobulinin çıkarılmasıyla elde edilir; Bu nedenle, bu, antikorları elde etmek için ağrısız ve oldukça verimli bir yöntemdir. Bu testin antikor tanıma kapasitesinin yüksek hassasiyetli doğrulanması için bir metodolojiye ek olarak, bu makale ayrıca bu antikorların ekstrakte edilmesi, antikorlar ve lateks boncuklar için en iyi bağlanma koşullarının belirlenmesi ve testin duyarlılığının belirlenmesi için bir yöntem sunmaktadır.

Şekil 2, asitleştirme yoluyla IgY antikorlarının ekstraksiyon işleminin grafiksel bir temsilini ve ardından kaprilik asit kullanılarak ayırmayı sağlar (Şekil 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> Şekil 2: IgY antikorlarının ekstraksiyon aşamasının şematik gösterimi ve kaprilik ...

Watch this Scientific Journal Video about Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies at JoVE.com

Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

Bu protokol, antijen tespiti için IgY antikorları kullanan tahliller için lateks boncukların hazırlanması için bir metodolojiyi açıklar.

Yumurta sarısı antikorlarına dayalı sitometrik boncuk testinin standardizasyonu

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

Hastalık teşhisine yönelik immünoassay teknikleri arasında sitometrik boncuk testi, tek bir tahlilde binlerce partikülü analiz ederek oldukça hassas ve güvenilir bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. Akış sitometrisinin yüksek doğruluğu, lateks boncukların düşük maliyeti ile birleştiğinde, tekniğimizi antikorlar ve antijenler gibi immünolojik test araçlarının analizi için uygulanabilir hale getirir. IgY antikorları düşük maliyetlidir ve üretimlerinde etik avantajlara sahiptir ve nadir hastalıklar için bir tespit aracı olarak kullanılabilir.Gallus gallus deckle beyaz soyundan yeni yumurtlanmış veya dört günlük yumurtaları% 0.2 seyreltilmiş sodyum hipoklorit çözeltisine batırarak başlayın. Akan su altında hızlıca durulayın ve nazikçe silin. Yumurtayı dikkatlice kırın, sarısını bir yumurta sarısı ayırıcı yardımıyla beyazından ayırın.Ve fazla beyazı filtre kağıdı ile çıkarın. Yumurta sarısını delin ve içini 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Yumurta sarısını kullanmadan önce en az 24 saat eksi 20 santigrat derecede saklayın.Depolanan yumurta sarısı çözüldükten sonra, bir milimolar PBS'de bir ila 10 oranında seyreltin. Çözeltinin pH'ını bir normal hidroklorik asit ile beşe ayarlayın ve çözeltiyi altı ila 24 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Çözeltiyi 3000 G'de 40 dakika santrifüjleyin ve süpernatantın pH'ını beşe yeniden ayarlamadan önce geri kazanılan süpernatanı 0.7 milimetrelik bir selüloz filtre kullanarak filtreleyin.Dört santigrat derecede 30 dakika boyunca sürekli karıştırarak% 8.7'lik bir nihai konsantrasyona kaprilik asit ekleyin. Numuneleri 15 dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı çökeltilmiş malzemeden ayırın. Bir molar sodyum hidroksit kullanarak çözeltinin pH'ını 7.4'e yeniden ayarlayın.Ve eksi 20 santigrat derecede saklamadan önce Bradford testini kullanarak antikorları ölçün. 21 mikrolitre lateks boncuklara 21 mikrolitre EDC ve 21 mikrolitre NHS ekleyin. Ve filtrelenmiş 10 milimolar PBS ile 2,1 mililitrelik son hacme ayarlayın.Çözeltiyi 22 santigrat derecede, hızlı çalkalayarak üç saat boyunca inkübe edin. Daha önce ekstrakte edilen yakalama antikoru IgY PfHRP2'yi, bu çözeltinin 100 mikrolitresini içeren farklı mikro tüplere ekleyin. Ve tekrar 16 saat inkübe edin.Numuneleri santrifüjledikten ve süpernatantları attıktan sonra, santrifüjleme ve yeniden süspansiyon döngüleri kullanarak lateks boncukları 500 mikrolitre filtrelenmiş 10 milimolar PBS ile iki kez yıkayın. Boncukların bloke edilmesi için, numuneleri bir mililitre bloke edici tampon içinde yeniden süspanse edin ve iki saat inkübe etmek için daha önce gösterilen prosedürün aynısını izleyin. Boncukları PBS ile yıkadıktan sonra, 10 milimolar PBS tamponunda tekrar süspanse edin.Her bir mikro tüpe 10 milimolar PBS ve BSA karışımında bir ila 2000'e seyreltilmiş 100 mikrolitre floresan anti-tavuk antikoru ekleyin. Örnekleri karanlıkta 30 dakika inkübe edin. Boncukları yıkadıktan sonra, 250 mikrolitre filtrelenmiş 10 milimolar PBS ile tekrar süspanse edin.Bloke edilmiş boncuk preparatının 100 mikrolitresini, farklı miktarlarda seyreltilmiş rekombinant protein PfHRP2'yi üç kopya halinde içeren tüplere dağıtarak tespit sınırını belirleyin. Boncuk çözeltilerini protein ile 22 santigrat derecede, hızlı çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin. Boncukları, daha önce gösterildiği gibi santrifüjleme ile 500 mikrolitre filtrelenmiş 10 milimolar PBS ile yıkayın.Süpernatanı attıktan sonra, her numuneye 10 milimolar PBS ve BSA'da seyreltilmiş rekombinant proteine karşı iki mikrogram fare IgG antikoru ekleyin ve inkübasyon için aynı prosedürü izleyin. Daha sonra, her numuneye 100 mikrolitre seyreltilmiş floresan anti-fare antikoru ekleyin. İnkübasyondan sonra, numuneyi 250 mikrolitre filtrelenmiş 10 milimolar PBS içinde yeniden süspanse edin.Bilgisayarı ve akış sitometresini açın ve ekipmanın bilgisayara bağlanması için birkaç dakika bekleyin. Bilgisayarda yüklü olan sitometri yazılımına tıklayın ve oturum açın. Yazılım çalışma alanından Sitometre'yi, ardından Fluidics Başlatma'yı, Temizleme Modları'nı ve SIT Flush'ı seçin.Negatif kontrol parçacığının morfometrik ve floresan özelliklerine dayalı geçit stratejisini tanımlayın. Hücre morfometrisini belirlemek için, yan dağılım A'yı kullanarak ileri dağılım A parametrelerinin analizi için nokta grafiği grafiğini seçin.Y ekseninde W yan saçılımının ve X ekseninde H yan saçılımının analizi için nokta grafiği grafiğini kullanarak tek hücreleri yan dağılıma göre belirleyin. Ve Y ekseninde ileri dağılım W ve X ekseninde ileri dağılım H analizi için nokta grafiği çizim grafiğini kullanarak tek hücreleri ileri dağılıma göre belirleyin.Floresan analizi için, ileri saçılma kullanarak FL1 nokta grafiği grafiklerini seçin A.Etiketlenmemiş numuneler ve daha önce tek renkli Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş numuneler içeren durduruculu bir polistiren tüp kullanın ve tüpün içeriğini dikkatlice karıştırın. Tüpü akış sitometresi probuna takın ve Al'a sol tıklayın. Lazerlerin gücünü ayarlamak için Parametreler'e tıklayın ve aşağıdaki seçeneklerde ileri saçılmanın voltajını 182 volta ve yan saçılmanın voltajını 236 volta ayarlayın.Sitometrede eşiği ayarlamak için Eşik'e tıklayın ve aşağıdaki seçeneklerde FSC'yi 500 volta ayarlayın. Parçacıkları boyut ve karmaşıklığa göre karakterize etmek ve tek hücre analizi yapmak için analiz kapısını ayarlayın. Yalnızca lateks boncukları içeren boyasız numuneyi analiz ederek ve FL1 FITC dedektörünün voltajını 332 volta ayarlayarak otofloresansı giderin.Floresan analiz kapısını, nokta grafiğinde gösterilen negatif noktadan dörtgen biçimde ayarlayın. Morfometrik ve floresan analizler ayarlandıktan sonra, cihazı 50.000 olay için yapılandırın ve Kaydet'e tıklayın. Kaprilik asit kullanılarak ayrılması nedeniyle IgY PfHRP2 antikorunun elektroforetik profilleri burada gösterilmektedir.Bu şekilden, kaprilik asit ayrılmasından önceki ve sonraki antikorların, IgY'nin hafif ve ağır zincirlerine atıfta bulunan 65 kilodalton ve 27 kilodaltonluk karakteristik bantlarla benzer elektroforetik profiller gösterdiği görülebilir. Bunlara ek olarak, muhtemelen C terminal fragmanı yumurta sarısı proteini vitellogenin II öncüsü nedeniyle başka bantlar da görülebilir. Lateks boncuklar üzerindeki antikor doygunluk konsantrasyonunun değerlendirilmesi, boncuklarla bir immünolojik test geliştirmek için hayati önem taşır.Kullanılan ticari lateks boncukların her bir mikrolitresine bağlı farklı antikor konsantrasyonlarının floresan yüzdesinin bir eğrisi burada gösterilmektedir. Konsantrasyon arttıkça, yüzde değerleri de arttı ve iki mikrogram antikor konsantrasyonunda plato haline geldi ve hedef antijen immünolojik testi için optimal birleştirme konsantrasyonu olarak belirlendi. Saptama sınırı, değişen rPfHRP2 protein konsantrasyonlarına karşı lateks hız reaktivitesinin floresan yüzdesi değerlendirilerek belirlendi.Bir sandviç immünolojik testten, floresansın 0.01 mikrogram PfHRP2 proteininden arttığı ve 0.1 mikrogramda plato olduğu gözlendi. Sıfır mikrogram ve 0.01 mikrogramda floresansta anlamlı bir fark yoktu. Bununla birlikte, floresanda 0.01 mikrogram, 0.1 mikrogram ve 10 mikrogramda önemli bir fark gözlendi.Bu protokolün yıkama adımı, boncukların kaybını önlemek için kritik öneme sahiptir. Elde edilen sonuçta hata olmaması için gösterge iyi tanımlanmalıdır. Burada açıklanan adımlar, tam sitometri ile değerlendirilen lateks boncuklar kullanılarak yapılan tanı testlerinin güvenilirliğini sağlamak için gerekli olan önemli bir standardizasyonu temsil etmektedir.Bu nedenle, bu metodoloji klasik sandviç test modellerine bir alternatiftir. Bu yöntem, çeşitli tahlil türlerine uygulanabilir ve boncukların yüzeyine birkaç molekülün çıkarılmasının yanı sıra farklı analitlerin tespiti için uygun olabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Elektrokimyasal algılama döteryum Kinetik izotop etkisi üzerinde ekstraselüler elektron taşıma Shewanella Corynebacterium Bay-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Parallel Interrogation of ÃƒÅ½Ã‚Â²-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

Β-Arrestin2 Ligand Tarama için PRESTO-Tango Tetkik ini Kullanarak GPCR-Geniş Ölçekte İşe Alımın Paralel Sorgulaması

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

MeCP2 Protein Varyantları için Elektrokemilüminesans Bazlı Bir Test

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...