Name: generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

نشكر جميع أعضاء مختبراتنا على مدخلاتهم واقتراحاتهم الهامة. تم دعم هذا البحث من قبل المشروع الرئيسي للجنة جيانغسو للصحة (K2019030). تم إجراء التصور من قبل C.W. و Z.C. ، وتم تنفيذ المنهجية بواسطة W.H. و M.L. ، وتم إجراء التحقيق بواسطة W.H. و M.L. ، وتم تنفيذ تنظيم البيانات بواسطة W.H. ، Z.Z. ، S.X. ، و M.L. ، وتم تنفيذ إعداد المسودة الأصلية بواسطة Z.Z. ، J.Z. ، S.X. ، W.H. ، و X.L. ، تم إجراء المراجعة والتحرير بواسطة Z.C. ، وتم تنفيذ إدارة المشروع بواسطة C.W. و Z.C. ، وتم إجراء الاستحواذ على التمويل بواسطة C.W. قرأ جميع المؤلفين النسخة المنشورة من المخطوطة ووافقوا عليها.

1. بناء كروي
<ol><li>معالجة مضادة للالتصاق للوحة الثقافة<ol><li>ماصة 100 ميكرولتر من الكاشف المضاد للالتصاق في كل بئر من صفيحة 48 بئر مع قاع بئر على شكل حرف U ، واحتفظ بها لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، قم بشفط كاشف الطلاء ، واغسله مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.</li>
		<li>ضع لوحة الاستزراع في ?...

<ol>
	<li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer.">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li><li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy.">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li><li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-Ts:+New+perspectives+in+cancer+therapy.">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li><li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world.">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li><li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy.">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 116 (2021).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture,+mechanical+loading,+and+real-time+monitoring+of+cells.">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)+ad+reactive+oxygen+species.">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Br&#252;ningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments.">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653 (2020).</li><li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer.">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns,+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models.">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography.">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).</li><li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy.">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition.">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).</li><li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape.">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment:+Cancer+cell+sensing,+mechanobiology+and+metastasis.">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li><li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+KRAS+cancers:+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance.">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).</li><li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy.">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li><li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis.">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li><li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids:+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis.">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li><li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery.">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103 (2016).</li></ol>

تلعب البيئة المكروية دورا مهما في نمو الورم. قد يؤثر على توفير المصفوفات خارج الخلية ، وتدرجات الأكسجين ، والتغذية ، والتفاعل الميكانيكي ، وبالتالي يؤثر على التعبير الجيني ، ومسارات الإشارة ، والعديد من وظائف الخلايا السرطانية19،20،21. في ?...

السرطان هو أحد الأمراض التي يخشاها البشر ، لأسباب ليس أقلها ارتفاع معدل الوفيات1. في السنوات الأخيرة ، زادت إمكانية علاج السرطان حيث تم إدخال علاجات جديدة2،3،4،5. تستخدم النماذج ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) في المختبر لدراسة السرطان في بيئة معملية. ومع ذلك ، لا يمكن لنماذج 2D تقييم جميع المعلمات المهمة التي تشير إلى حساسية مضادة للأورام على الفور وبدقة ؛ لذلك ، فشلوا في التمثيل الكامل للتفاعلات في الجسم الحي في اختبار العلاج الدوائي6.
منذ عام 2020 ، تم تعزيز سوق الثقافة العالمية ثلاثية الأبعاد (3D) بشكل كبير. وفقا لأحد التقارير الصادرة عن NASDAQ OMX ، ستتجاوز القيمة العالمية لسوق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد 2.7 مليار دولار أمريكي بحلول نهاية عام 2025. بالمقارنة مع طرق الثقافة 2D ، فإن زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد تعرض خصائص مفيدة ، والتي يمكن تحسينها ليس فقط للانتشار والتمايز ولكن أيضا للبقاء على المدى الطويل 7,8. بهذه الوسائل ، يمكن محاكاة البيئات الدقيقة الخلوية في الجسم الحي للحصول على توصيف أكثر دقة للورم ، وكذلك التنميط الأيضي ، بحيث يمكن فهم التغيرات الجينومية والبروتينية بشكل أفضل. ونتيجة لذلك ، يجب الآن تضمين أنظمة اختبار 3D في عمليات تطوير الأدوية السائدة ، خاصة تلك التي تركز على فحص وتقييم الأدوية الجديدة المضادة للأورام. تمتلك النموات ثلاثية الأبعاد لخطوط الخلايا الراسخة الخالدة أو مزارع الخلايا الأولية في الهياكل الكروية في الجسم الحي سمات الأورام مثل نقص الأكسجة واختراق الأدوية ، بالإضافة إلى تفاعل الخلايا والاستجابة والمقاومة ، ويمكن اعتبارها نموذجا صارما وتمثيليا لأداء فحص المخدرات في المختبر 9،10،11.
ومع ذلك ، فإن نماذج ثقافة 3D هذه تعاني أيضا من العديد من المشكلات التي قد تستغرق بعض الوقت لحلها. يمكن تشكيل كرويات الخلية باستخدام هذه البروتوكولات ، لكنها تختلف في تفاصيل معينة ، مثل وقت المزرعة أو تضمين المواد الهلامية12 ، لذلك لا يمكن التحكم في هذه الكرويات الخلوية المبنية بشكل جيد في نطاق حجم محدود. قد يؤثر حجم الأجسام الكروية على اتساق اختبار الجدوى وتحليل التصوير. تختلف أيضا البيئات الدقيقة للنمو وعوامل النمو ، مما قد يؤدي إلى أشكال مختلفة بسبب الاختلافات في التمايز بين الخلايا13. هناك الآن حاجة واضحة لطريقة قياسية وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة لبناء جميع أنواع الأورام بأحجام خاضعة للرقابة.
من منظور آخر ، على الرغم من تطوير المقايسات المتجانسة وأساليب التصوير عالية المحتوى لتقييم التشكل والجدوى ومعدل النمو ، إلا أن الفحص عالي الإنتاجية لنماذج 3D لا يزال يمثل تحديا لأسباب مختلفة تم الإبلاغ عنها في الأدبيات ، مثل عدم التوحيد في موضع وحجم ومورفولوجيا كرويات الورم14،15،16.
في البروتوكول المقدم هنا ، ندرج كل خطوة في بناء كرويات الورم 3D ونصف طريقة لمراقبة وتحليل كروية باستخدام نظام تصوير عالي الإنتاجية وعالي المحتوى يتضمن التركيز التلقائي والتصوير التلقائي والتحليل ، من بين خصائص مفيدة أخرى. نظهر كيف يمكن لهذه الطريقة إنتاج كرويات الورم 3D ذات الحجم الموحد المناسبة للتصوير عالي الإنتاجية. تظهر هذه الكرويات أيضا حساسية عالية لعلاج أدوية السرطان ، ويمكن مراقبة التغيرات المورفولوجية في الكائنات الكروية باستخدام التصوير عالي المحتوى. باختصار ، نظهر متانة هذه المنهجية كوسيلة لتوليد تركيبات الورم 3D لأغراض تقييم المخدرات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;mL Boil proof microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000&#956;L Pipette tips</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D gel</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>MA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well U bottom Plate</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>P02-48UWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>&#160;DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>W433884-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware&#160;</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware&#160;</td>
			<td>GraphPad software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Content Microscope and SMART system</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>1-I01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin Sol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Fluoroskan Ascent</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>JET Biofil</td>
			<td>TCF012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25% (1X)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies

في العقود الأخيرة ، بالإضافة إلى الخلايا المستزرعة أحادية الطبقة ، تم تطوير كرويات الورم ثلاثية الأبعاد كأداة قوية محتملة لتقييم الأدوية المضادة للسرطان. ومع ذلك ، فإن طرق الاستزراع التقليدية تفتقر إلى القدرة على التعامل مع كرويات الورم بطريقة متجانسة على المستوى ثلاثي الأبعاد. لمعالجة هذا القيد ، في هذه الورقة ، نقدم طريقة مريحة وفعالة لبناء كرويات الورم متوسطة الحجم. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة للتحليل القائم على الصور باستخدام برنامج التحليل القائم على الذكاء الاصطناعي الذي يمكنه مسح اللوحة بأكملها والحصول على بيانات عن كرويات ثلاثية الأبعاد. تمت دراسة العديد من المعلمات. باستخدام طريقة قياسية لبناء كروي الورم ونظام تصوير وتحليل عالي الإنتاجية ، يمكن زيادة فعالية ودقة اختبارات الأدوية التي يتم إجراؤها على كرويات ثلاثية الأبعاد بشكل كبير.

يوضح الشكل 1 أ ، ب العملية المستخدمة لبناء كرويات الورم في هذه الدراسة. قمنا أولا بزرع الخلايا في صفيحة قاع U ذات 48 بئرا. هذه الخطوة هي تقريبا نفس الخطوة المستخدمة في ثقافة الخلايا 2D. احتفظنا بالصفيحة في حاضنة مشتركة مع المياه المحيطة بالآبار بحيث بدأت الخلايا المتر...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

توضح هذه المقالة طريقة موحدة لبناء كرويات الورم ثلاثية الأبعاد. كما تم وصف استراتيجية للمراقبة الكروية وتحليل التعلم العميق القائم على الصور باستخدام نظام التصوير الآلي.

توليد كرويات الورم 3D لدراسات تقييم المخدرات

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

أظهر هذا البروتوكول طريقة موحدة لبناء أورام ثلاثية الأبعاد من الأجسام الكروية. وقدمت هذه المنهجية دائرة عالية وتحليل محتوى عالي لتركيبات الورم 3D. باستخدام طريقة قياسية لبناء كروي الورم ونظام تصوير وتحليل عالي الإنتاجية ، يمكن زيادة فعالية ودقة اختبارات الأدوية التي تشكلت على كرويات ثلاثية الأبعاد بشكل كبير.في هذا البروتوكول ، استخدمنا AMG510 لعلاج كروي NCI-H23 كمثال. من التجربة ، يمكننا ملاحظة تأثير كبير للدواء السرطاني المستهدف على كرويات الورم. للبدء ، ماصة 100 ميكرولتر من كاشف مضاد الالتصاق في كل بئر من صفيحة بئر 48 مع قاع بئر على شكل حرف U واحتفظ بها لمدة 10 دقائق.بعد 10 دقائق ، نضح كاشف الطلاء واغسله مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني معقم. ضع طبق الاستزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية في هواء مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الاستخدام. مراقبة الخلايا تحت المجهر.بعد ذلك ، اغسل الخلايا المزروعة في قارورة T25 مرتين باستخدام PBS لإزالة وسط المزرعة ومعالجة الخلايا الموسعة بملليلتر واحد من 0.25٪ trypsin EDTA لمدة دقيقة إلى دقيقتين في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تأكيد شكل الخلية تحت المجهر. ثم أوقف علاج التربسين عن طريق استنشاق معلق التربسين EDTA المستخدم في قارورة T25 وغسل الخلايا بأربعة ملليلتر من الوسط الطازج.انقل كل المعلق إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا واستخدم ملليلترا واحدا من الوسط الطازج لغسل الخلايا المتبقية وإضافته إلى الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 186.48 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية. أضف 10 ملليلتر من الوسط الطازج إلى حبيبات الخلية وماصة بلطف حتى تصبح الخلايا في تعليق متجانس.نضح 0.1 ملليلتر من تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي جديد. أضف 0.9 ملليلتر من الوسط الطازج ثم ماصة التعليق جيدا. استخراج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لعد الخلايا.كرر هذه العملية مرة أو مرتين وخذ قيمة متوسطة. تمييع التعليق للوصول إلى كثافة البذر النهائية من 50،000 خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة قاع U 48 بئرا.لف فيلم الختم حول اللوحة وجهاز الطرد المركزي عند 119.35 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، اسحب الفيلم الواقي وأضف خمسة إلى ثمانية ملليلتر من الماء المعقم في قناة المياه المحيطة بالآبار. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام.لا تقم بتغيير أو تكملة أي ماء إلى قناة المياه خلال هذه الفترة ولاحظ تجمع الخلايا خلال الأيام الخمسة التالية. لتضمين الجل ، بعد إخراج الجل المجمد من الثلاجة التي تبلغ درجة حرارتها 20 درجة مئوية تحت الصفر ، ضعه على صندوق ثلج طوال الوقت أثناء التجربة. مراقبة كرويات الخلية تحت المجهر.قبل أن يبدأ تضمين الجل ، يجب التحقق من حالة الأجسام الكروية مرة أخرى. قم بإزالة 150 ميكرولترا من الوسط بعناية وقم بتضمين كل كروي في الجل عن طريق إضافة الجل السائل ببطء من جانب جدار البئر أثناء تحريك طرف الماصة المبرد مسبقا حول البئر وداخله. انتظر لمدة خمس دقائق وإذا لم ينتشر الجل بالتساوي ، ماصة الجل برفق بطرف ماصة 10 ميكرولتر.يحتوي كل بئر على ورم كروي ، 25 ميكرولتر من 3.5 ملليغرام لكل هلام ملليلتر ، و 50 ميكرولتر من وسط الاستزراع الكامل. أضف 75 ميكرولترا من الوسط إلى عناصر التحكم أيضا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى يكتمل الهلام المائي بالكامل.تأكيد حالة الهلام تحت المجهر. تراكب 125 ميكرولتر من الوسط الطازج على كل عينة وزراعة الكرويات لمدة 7 إلى 10 أيام أخرى. قم بإعداد مجموعات من الأجسام الكروية مع أربعة إلى ستة آبار لكل منها واختر ثلاثة منها على الأقل للتحليل.حل الدواء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وإعداد حلول العمل 100 أضعاف مع DMSO. استخدم 0.1٪ DMSO كعنصر تحكم إيجابي وأضف 125 ميكرولترا من الوسط المعالج بالعقاقير إلى كل بئر. ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في هواء مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في هذه المرحلة ، يحتوي كل بئر على ورم كروي ، 25 ميكرولتر من 3.5 ملليغرام لكل هلام ملليلتر ، و 175 ميكرولتر من الوسط. تحتوي عناصر التحكم على 200 ميكرولتر من الوسط. قم بقياس الصلاحية الكروية باستخدام مجموعة مقايسة alamarBlue وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.نضح 100 ميكرولتر من الوسط الطافي من كل بئر إلى لوحة اختبار جديدة. بعد ذلك ، قم بقياس الجدوى باستخدام مقياس ضوئي للصفائح الدقيقة. قم بقياسه في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10 بعد تضمين الكرات في الجل.أضف 80 ميكرولترا من الوسط الطازج إلى كل بئر من طبق الاستزراع. ثم استبدل 100 ميكرولتر أخرى من الوسط المعالج بالعقاقير. تأكد من عدم وجود بقايا من الامار بلو في البئر.نضح 100 ميكرولتر من الوسط قبل التصوير ووضع اللوحة على المسرح. الحصول على صور رقمية للكرويات باستخدام مجهر آلي بهدف عشرة أضعاف. يمكن للمجهر تركيز هذه الكرويات ومركزيتها تلقائيا.انتظر التصوير التلقائي. يتم الحصول على أربع صور لكل كروي. يتم تشكيل صورة متكاملة ومعالجتها باستخدام البرنامج المتصل بنظام التصوير عالي المحتوى.انقر فوق زر عملية تصحيح الصور واختر الصور المدمجة في البرنامج. اختر نموذج U net واكتب معدل التحويل. انقر في الجزء السفلي من الشاشة لبدء معالجة الصور.احفظ بيانات القطر والمحيط والخشونة في برنامج جداول البيانات. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط الطازج مع الدواء وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في الهواء المرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يظهر في هذا الشكل صور برايت فيلد لكرويات الخلايا NCI-H23 المعالجة بتركيزات مختلفة من AMG510 والتي تم التقاطها تلقائيا بواسطة مجهر عالي المحتوى.تمثل الأعمدة أياما مختلفة وتمثل الصفوف تركيزات مختلفة من المخدرات. وتشمل النتائج ثلاث كرويات لكل حالة. تم قياس صلاحية كروية الورم لمجموعات العينات المعالجة AMG510 في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10.يظهر هذا الشكل صلاحية الخلية الطرفية للعينات ذات تدرجات التركيز. تم قياس أقطار كروية الورم في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10. تم تعريف نسبة النمو الكروي على أنها الحجم النهائي بالنسبة للحجم الأصلي وحسابها باستخدام أقطار كروية.تم تعريف نسبة تثبيط النمو الكروي بالنسبة للحجم وحسابها باستخدام أقطار كروية. تم قياس خشونة الورم بواسطة البرنامج في اليوم الأول واليوم الرابع واليوم السابع واليوم 10 ، مما يشير إلى غزو كرويات الورم. تم تحديد محيط الكروي ورسمه بواسطة البرنامج باستخدام خوارزميات التعلم العميق.ثم تم قياس المناطق الكروية في المستوى البؤري بواسطة الصورة J وتم حساب مؤشر محيط زائد بناء على هذه البيانات. على الرغم من سهولة متابعة هذه الرسالة ، إلا أن العينات لا تزال بحاجة إلى التعامل معها بعناية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

في فيفو نموذج لاختبار تأثير نقص الأكسجة على الانبثاث ورم

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

باراميكسوفيروسيس لاستهداف الورم المرباة: التصميم والتقييم السابقين فيفو

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

رصد المورفولوجية والفسيولوجية طولية من الماغنيسيوم الورم ثلاثي الأبعاد باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

إنشاء وتوصيف الأمعاء العصبية الصغيرة ورم الغدد الصماء خزان

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

رواية سترومال ليفيبليوم-تعديل 3D نموذج الورم كرويويد لدراسة الورم ستروما التفاعل واكتشاف المخدرات

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...