Name: generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

Vi takker alle medlemmer af vores laboratorier for deres kritiske input og forslag. Denne forskning blev støttet af nøgleprojektet fra Jiangsu Commission of Health (K2019030). Konceptualisering blev udført af C.W. og Z.C., metoden blev udført af W.H. og M.L., undersøgelsen blev udført af W.H. og M.L., datakurateringen blev udført af W.H., Z.Z., S.X. og M.L., det oprindelige udkast til forberedelse blev udført af Z.Z., J.Z., S.X., W.H., og X.L., blev gennemgangen og redigeringen udført af Z.C., projektadministrationen blev udført af C.W. og Z.C., og finansieringserhvervelsen blev udført af C.W. Alle forfatterne har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

1. Spheroid konstruktion
<ol><li>Anti-vedhæftningsbehandling af kulturpladen<ol><li>Der pipetteres 100 μL antiadhæsionsreagens i hvert hul i en 48-brønds plade med en U-formet brøndbund, og opbevares i 10 min. Efter 10 minutter aspireres belægningsreagenset, og vaskes to gange med steriliseret PBS.</li>
		<li>Kulturpladen anbringes i en inkubator (37 °C i befugtet luft med 5 % CO2) indtil brug.</li>
	</ol></li>
	<li>Celleforberedelse, indsamling og tælling<ol><li>Brug det dyrkningsme...

<ol>
	<li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer.">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li><li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy.">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li><li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-Ts:+New+perspectives+in+cancer+therapy.">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li><li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world.">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li><li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy.">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 116 (2021).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture,+mechanical+loading,+and+real-time+monitoring+of+cells.">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)+ad+reactive+oxygen+species.">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Br&#252;ningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments.">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653 (2020).</li><li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer.">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns,+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models.">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography.">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).</li><li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy.">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition.">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).</li><li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape.">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment:+Cancer+cell+sensing,+mechanobiology+and+metastasis.">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li><li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+KRAS+cancers:+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance.">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).</li><li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy.">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li><li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis.">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li><li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids:+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis.">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li><li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery.">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103 (2016).</li></ol>

Mikromiljøet spiller en vigtig rolle i tumorvækst. Det kan påvirke tilvejebringelsen af ekstracellulære matricer, iltgradienter, ernæring og mekanisk interaktion og dermed påvirke genekspression, signalveje og mange funktioner i tumorceller 19,20,21. I mange tilfælde producerer 2D-celler ikke sådanne virkninger eller producerer endda modsatte virkninger, hvilket påvirker evalueringen af lægemiddelbehandlinger. Fremkoms...

Kræft er en af de sygdomme, som mennesker frygter mest, ikke mindst på grund af den høje dødelighed1. I de senere år er muligheden for behandling af kræft steget, da nye terapier er blevet introduceret 2,3,4,5. Todimensionelle (2D) og tredimensionelle (3D) in vitro-modeller bruges til at studere kræft i laboratorieomgivelser. Imidlertid kan 2D-modeller ikke umiddelbart og nøjagtigt vurdere alle de vigtige parametre, der indikerer antitumorfølsomhed; Derfor repræsenterer de ikke fuldt ud in vivo-interaktioner i lægemiddelterapitest6.
Siden 2020 er det globale tredimensionelle (3D) kulturmarked blevet stærkt boostet. Ifølge en rapport fra NASDAQ OMX vil den globale værdi af markedet for 3D-cellekultur overstige USD 2,7 milliarder ved udgangen af 2025. Sammenlignet med 2D-kulturmetoder udviser 3D-celledyrkning fordelagtige egenskaber, som ikke kun kan optimeres til spredning og differentiering, men også til langsigtet overlevelse 7,8. På denne måde kan in vivo cellulære mikromiljøer simuleres for at opnå mere nøjagtig tumorkarakterisering såvel som metabolisk profilering, således at genomiske og proteinændringer bedre kan forstås. På grund af dette bør 3D-testsystemer nu indgå i almindelige lægemiddeludviklingsoperationer, især dem med fokus på screening og evaluering af nye antitumorlægemidler. Tredimensionelle vækster af udødeliggjorte etablerede cellelinjer eller primære cellekulturer i sfæroidstrukturer besidder in vivo-træk ved tumorer såsom hypoxi og lægemiddelpenetration samt celleinteraktion, respons og resistens og kan betragtes som en streng og repræsentativ model til udførelse af in vitro-lægemiddelscreening 9,10,11.
Disse 3D-kulturmodeller lider dog også af flere problemer, der kan tage lidt tid at løse. Cellesfæroider kan dannes ved hjælp af disse protokoller, men de adskiller sig i visse detaljer, såsom dyrkningstid eller indlejringsgeler12, så disse konstruerede cellesfæroider kan ikke kontrolleres godt under et begrænset størrelsesområde. Størrelsen af sfæroiderne kan påvirke konsistensen af levedygtighedstesten og billeddannelsesanalysen. Vækstmikromiljøerne og vækstfaktorerne varierer også, hvilket kan føre til forskellige morfologier på grund af forskelle i differentieringen mellem celler13. Der er nu et indlysende behov for en standard, enkel og omkostningseffektiv metode til konstruktion af alle typer tumorer med kontrollerede størrelser.
Fra et andet perspektiv, selvom homogene assays og billeddannelsesmetoder med højt indhold er blevet udviklet til evaluering af morfologi, levedygtighed og vækstrate, forbliver screening med høj kapacitet af 3D-modeller en udfordring af forskellige årsager, der er rapporteret i litteraturen, såsom manglen på ensartethed i position, størrelse og morfologi af tumorsfæroider14,15,16.
I protokollen, der præsenteres her, viser vi hvert trin i konstruktionen af 3D-tumorsfæroider og beskriver en metode til sfærisk observation og analyse ved hjælp af et billeddannelsessystem med høj gennemstrømning og højt indhold, der involverer autofokus, autobilleddannelse og analyse blandt andre fordelagtige egenskaber. Vi viser, hvordan denne metode kan producere 3D-tumorsfæroider af ensartet størrelse, der er egnede til billeddannelse med høj kapacitet. Disse sfæroider viser også en høj følsomhed over for kræftlægemiddelbehandling, og morfologiske ændringer i sfæroider kan overvåges ved hjælp af billeddannelse med højt indhold. Sammenfattende demonstrerer vi robustheden af denne metode som et middel til at generere 3D-tumorkonstruktioner til lægemiddelevalueringsformål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;mL Boil proof microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000&#956;L Pipette tips</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D gel</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>MA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well U bottom Plate</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>P02-48UWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>&#160;DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>W433884-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware&#160;</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware&#160;</td>
			<td>GraphPad software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Content Microscope and SMART system</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>1-I01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin Sol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Fluoroskan Ascent</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>JET Biofil</td>
			<td>TCF012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25% (1X)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies

I de seneste årtier er der ud over monolagsdyrkede celler udviklet tredimensionelle tumorsfæroider som et potentielt kraftfuldt værktøj til evaluering af kræftlægemidler. Imidlertid mangler de konventionelle kulturmetoder evnen til at manipulere tumorsfæroiderne på en homogen måde på det tredimensionelle niveau. For at løse denne begrænsning præsenterer vi i dette papir en bekvem og effektiv metode til konstruktion af gennemsnitlige tumorsfæroider. Derudover beskriver vi en metode til billedbaseret analyse ved hjælp af kunstig intelligens-baseret analysesoftware, der kan scanne hele pladen og få data om tredimensionelle sfæroider. Flere parametre blev undersøgt. Ved at anvende en standardmetode til tumorsfæroidkonstruktion og et billeddannelses- og analysesystem med høj kapacitet kan effektiviteten og nøjagtigheden af lægemiddeltest udført på tredimensionelle sfæroider øges dramatisk.

Figur 1A,B viser den proces, der anvendes til konstruktion af tumorsfæroider i denne undersøgelse. Vi såede først cellerne i en 48-brønds U-bundplade. Dette trin er næsten det samme som det, der anvendes i 2D-cellekultur. Vi opbevarede pladen i en fælles inkubator med vand omkring brøndene, så de aflejrede celler begyndte at danne sfæroider i en selvmonteringsproces. Under normale driftsforhold blev de fleste typer tumorsfæroider fuldstændigt dannet efter 5 dage...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Denne artikel demonstrerer en standardiseret metode til konstruktion af tredimensionelle tumorsfæroider. En strategi for sfærisk observation og billedbaseret dyb læringsanalyse ved hjælp af et automatiseret billeddannelsessystem beskrives også.

Generering af 3D-tumorsfæroider til lægemiddelevalueringsundersøgelser

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Denne protokol demonstrerede en standardiseret metode til konstruktion af tredimensionelle tumorer af sfæroider. Og denne metode gav en høj kredsløb og høj indholdsanalyse af 3D-tumorkonstruktioner. Ved at anvende en standardmetode til tumorøs sfærisk konstruktion og et billeddannelses- og analysesystem med høj kapacitet kan effektiviteten og nøjagtigheden af lægemiddeltest dannet på tredimensionelle sfæroider øges dramatisk.I denne protokol brugte vi AMG510 til at behandle NCI-H23 sfæroid som et eksempel. Fra eksperimentet kunne vi observere en signifikant effekt af kræftmålrettet lægemiddel på tumorsfæroiderne. Til at begynde med pipetteres 100 mikroliter antiadhæsionsreagens i hver brønd i en 48 brøndplade med en U-formet brøndbund og opbevares i 10 minutter.Efter 10 minutter aspireres belægningsreagenset og vaskes to gange med steriliseret PBS. Anbring kulturpladen i en inkubator ved 37 grader Celsius i befugtet luft med 5% kuldioxid indtil brug. Overhold cellerne under mikroskopet.Derefter vaskes cellerne dyrket i en T25-kolbe to gange med PBS for at fjerne dyrkningsmediet og behandle de ekspanderede celler med en milliliter 0,25% trypsin EDTA i et til to minutter i en inkubator ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid. Bekræft celleformen under mikroskopet. Og stop derefter trypsinbehandlingen ved at aspirere den brugte trypsin EDTA-suspension i T25-kolben og vaske cellerne med fire ml frisk medium.Overfør hele suspensionen til et 15 ml rør og brug en milliliter frisk medium til at vaske de resterende celler ned og tilsæt det til røret. Cellerne centrifugeres ved 186,48 G i fem minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres. Tilsæt 10 ml frisk medium til cellepillen og pipette forsigtigt, indtil cellerne er i en homogen suspension.Opsug 0,1 ml cellesuspension i et nyt centrifugerør. Tilsæt 0,9 ml frisk medium og pipette derefter suspensionen godt. Uddrag 10 mikroliter af cellesuspensionen til celletælling.Gentag denne proces en eller to gange, og tag en gennemsnitsværdi. Fortynd suspensionen for at nå en endelig såtæthed på 50.000 celler pr. Milliliter. Derefter tilsættes 200 mikroliter cellesuspension til hver brønd i en 48 brønd U-bundplade.Forseglingsfilmen vikles rundt om pladen og centrifugeres ved 119,35 G i fem minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering trækkes beskyttelsesfilmen af og tilsættes fem til otte ml steriliseret vand i vandkanalen omkring brøndene. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i fem dage.Du må ikke ændre eller supplere vand til vandkanalen i denne periode, og observer celleaggregeringen i løbet af de følgende fem dage. Til gelindlejringen, efter at have taget den frosne gel ud af minus 20 grader Celsius køleskabet, skal du placere den på en isboks hele tiden under eksperimentet. Overhold cellesfæroiderne under mikroskopet.Før gelindlejringen begynder, skal sfæroidernes status igen kontrolleres. Fjern forsigtigt 150 mikroliter af mediet og indlejr hver sfæroid i gelen ved langsomt at tilsætte den flydende gel fra brøndens vægside, mens den forkølede pipettespids flyttes rundt og inde i brønden. Vent i fem minutter, og hvis gelen ikke spredes jævnt, pipetteres gelen forsigtigt med en pipettespids på 10 mikroliter.Hver brønd indeholder en tumorsfæroid, 25 mikroliter 3,5 milligram pr. milliliter gel og 50 mikroliter komplet kulturmedium. Tilsæt også 75 mikroliter medium til kontrollerne. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i 30 minutter, indtil hydrogeleringen er helt afsluttet.Bekræft geleringsstatus under mikroskopet. Overlejr 125 mikroliter frisk medium på hver prøve og kultur sfæroiderne i yderligere 7 til 10 dage. Forbered grupper af sfæroider med fire til seks brønde hver og vælg mindst tre af dem til analyse.Opløs lægemidlet i henhold til producentens anvisninger og forbered 100 fold arbejdsløsninger med DMSO. Brug 0,1% DMSO som en positiv kontrol og tilsæt 125 mikroliter lægemiddelbehandlet medium til hver brønd. Placer pladen tilbage i inkubatoren ved 37 grader Celsius i befugtet luft med 5% kuldioxid.På dette stadium indeholder hver brønd en tumorsfæroid, 25 mikroliter 3,5 milligram pr. milliliter gel og 175 mikroliter medium. Kontrollerne indeholder 200 mikroliter af mediet. Mål sfæroidlevedygtigheden ved hjælp af et alamarBlue-analysesæt i henhold til producentens retningslinjer.Der suges 100 mikroliter supernatant fra hvert hul til en ny prøveplade. Mål derefter levedygtigheden ved hjælp af et mikropladefotometer. Mål det på dag et, dag fire, dag syv og dag 10 efter indlejring af sfæroiderne i gelen.Tilsæt 80 mikroliter frisk medium til hvert hul på kulturpladen. Udskift derefter yderligere 100 mikroliter af det lægemiddelbehandlede medium. Sørg for, at der ikke er rester af alamarBlue i brønden.Opsug 100 mikroliter af mediet ud før billeddannelse, og placer pladen på scenen. Få digitale billeder af sfæroider ved hjælp af et automatiseret mikroskop med et ti gange mål. Mikroskopet kan fokusere og centralisere disse sfæroider automatisk.Vent på den automatiske billeddannelse. Fire billeder erhverves for hver sfæroide. Et integreret billede dannes og behandles med softwaren, der er tilsluttet billedbehandlingssystemet med højt indhold.Klik på billedpatch-procesknappen, og vælg de integrerede billeder i softwaren. Vælg U netmodel, og indtast konverteringsfrekvensen. Klik nederst på skærmen for at starte billedbehandlingen.Gem data om diameter, omkreds og ruhed i regnearkssoftwaren. Endelig tilsættes 100 mikroliter frisk medium med lægemidlet og placeres pladen tilbage i inkubatoren ved 37 grader Celsius i befugtet luft med 5% kuldioxid. Brightfield-billederne af NCI-H23-cellesfæroider behandlet med forskellige koncentrationer af AMG510 og automatisk fanget af et højindholdsmikroskop er vist i denne figur.Kolonnerne repræsenterer forskellige dage, og rækkerne repræsenterer forskellige lægemiddelkoncentrationer. Resultaterne omfatter tre sfæroider for hver tilstand. Tumorsfæroid levedygtighed af de AMG510-behandlede prøvegrupper blev målt på dag et, dag fire, dag syv og dag 10.Den terminale cellelevedygtighed af prøverne med koncentrationsgradienter er vist i denne figur. Tumorsfæroiddiametrene blev målt på dag et, dag fire, dag syv og dag 10. Det sfæroide vækstforhold blev defineret som terminalvolumenet i forhold til det oprindelige volumen og beregnet ved hjælp af sfæroiddiametrene.Det sfæroidvæksthæmningsforhold blev defineret i forhold til volumenet og beregnet ved hjælp af sfæroiddiametrene. Tumorens ruhed blev målt af softwaren på dag et, dag fire, dag syv og dag 10, hvilket indikerer invasiviteten af tumorsfæroiderne. Sfæroidens omkreds blev placeret og tegnet af softwaren ved hjælp af deep learning-algoritmer.De sfæroide områder på brændplanet blev derefter målt med billede J, og et overskydende perimeterindeks blev beregnet ud fra disse data. Selvom denne meddelelse er let at følge, skal prøverne stadig håndteres omhyggeligt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In vivo-model for prøvetagning Virkning af Hypoxi på tumormetastase

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus for Tumor-målrettet Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvågning af tre-dimensionelle Tumor Spheroids bruge optisk kohærens tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient afledte 3D Sfæroider til anti-neoplastisk Drug screening for at målrette kræft stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering af små tarm neuroendokrine tumor Sfæroider

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Moduleret 3D Tumor Spheroid Model for at studere Tumor-Stroma Interaktion og Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...