Name: generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

We danken alle leden van onze laboratoria voor hun kritische inbreng en suggesties. Dit onderzoek werd ondersteund door het Key Project van Jiangsu Commission of Health (K2019030). Conceptualisatie werd uitgevoerd door C.W. en Z.C., de methodologie werd uitgevoerd door W.H. en M.L., het onderzoek werd uitgevoerd door W.H. en M.L., de datacuratie werd uitgevoerd door W.H., Z.Z., S.X., en M.L., de oorspronkelijke conceptvoorbereiding werd uitgevoerd door Z.Z., J.Z., S.X., W.H., en X.L., de beoordeling en bewerking werd uitgevoerd door Z.C., de projectadministratie werd uitgevoerd door C.W. en Z.C., en de financieringsacquisitie werd uitgevoerd door C.W. Alle auteurs hebben de gepubliceerde versie van het manuscript gelezen en ermee ingestemd.

1. Sferoïde constructie
<ol><li>Anti-hechtingsbehandeling van de kweekplaat<ol><li>Pipetteer 100 μL anti-adhesiereagens in elke put van een 48-putplaat met een U-vormige putbodem en bewaar gedurende 10 minuten. Zuig na 10 minuten het coatingreagens op en was tweemaal met gesteriliseerde PBS.</li>
		<li>Plaats de kweekplaat in een incubator (37 °C in bevochtigde lucht met 5% CO2) tot gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Celvoorbereiding, verzameling en tellen<ol><li>Gebruik het kweekmedium dat s...

<ol>
	<li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer.">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li><li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy.">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li><li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-Ts:+New+perspectives+in+cancer+therapy.">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li><li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world.">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li><li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy.">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 116 (2021).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture,+mechanical+loading,+and+real-time+monitoring+of+cells.">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)+ad+reactive+oxygen+species.">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Br&#252;ningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments.">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653 (2020).</li><li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer.">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns,+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models.">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography.">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).</li><li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy.">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition.">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).</li><li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape.">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment:+Cancer+cell+sensing,+mechanobiology+and+metastasis.">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li><li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+KRAS+cancers:+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance.">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).</li><li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy.">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li><li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis.">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li><li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids:+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis.">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li><li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery.">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103 (2016).</li></ol>

De micro-omgeving speelt een belangrijke rol bij tumorgroei. Het kan de levering van extracellulaire matrices, zuurstofgradiënten, voeding en mechanische interactie beïnvloeden en dus de genexpressie, signaalroutes en vele functies van tumorcellen beïnvloeden 19,20,21. In veel gevallen produceren 2D-cellen dergelijke effecten niet of zelfs tegengestelde effecten, waardoor de evaluatie van medicamenteuze behandelingen wordt be...

Kanker is een van de ziekten die het meest gevreesd wordt door de mens, niet in de laatste plaats vanwege het hoge sterftecijfer1. In de afgelopen jaren is de mogelijkheid om kanker te behandelen toegenomen omdat nieuwe therapieën zijn geïntroduceerd 2,3,4,5. Tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) in vitro modellen worden gebruikt om kanker in een laboratoriumomgeving te bestuderen. 2D-modellen kunnen echter niet onmiddellijk en nauwkeurig alle belangrijke parameters beoordelen die wijzen op antitumorgevoeligheid; daarom slagen ze er niet in om in vivo interacties volledig weer te geven bij het testen van medicamenteuze therapie6.
Sinds 2020 is de wereldwijde driedimensionale (3D) cultuurmarkt sterk gestimuleerd. Volgens een rapport van NASDAQ OMX zal de wereldwijde waarde van de 3D-celkweekmarkt tegen het einde van 2025 meer dan USD 2,7 miljard bedragen. In vergelijking met 2D-kweekmethoden vertoont 3D-celkweek voordelige eigenschappen, die niet alleen kunnen worden geoptimaliseerd voor proliferatie en differentiatie, maar ook voor overleving op lange termijn 7,8. Op dergelijke manieren kunnen in vivo cellulaire micro-omgevingen worden gesimuleerd om nauwkeurigere tumorkarakterisering te verkrijgen, evenals metabole profilering, zodat genomische en eiwitveranderingen beter kunnen worden begrepen. Daarom moeten 3D-testsystemen nu worden opgenomen in reguliere geneesmiddelenontwikkelingsoperaties, vooral die met een focus op het screenen en evalueren van nieuwe antitumorgeneesmiddelen. Driedimensionale gezwellen van vereeuwigde gevestigde cellijnen of primaire celculturen in sferoïde structuren bezitten in vivo kenmerken van tumoren zoals hypoxie en geneesmiddelpenetratie, evenals celinteractie, respons en resistentie, en kunnen worden beschouwd als een strikt en representatief model voor het uitvoeren van in vitro geneesmiddelenscreening 9,10,11.
Deze 3D-cultuurmodellen hebben echter ook last van verschillende problemen die enige tijd kunnen duren om op te lossen. Celsferoïden kunnen worden gevormd met behulp van deze protocollen, maar ze verschillen in bepaalde details, zoals kweektijd of inbeddingsgels12, dus deze geconstrueerde celsferoïden kunnen niet goed worden gecontroleerd onder een beperkt groottebereik. De grootte van de sferoïden kan de consistentie van de levensvatbaarheidstest en beeldvormingsanalyse beïnvloeden. De groeimicro-omgevingen en groeifactoren variëren ook, wat kan leiden tot verschillende morfologieën als gevolg van verschillen in de differentiatie tussen cellen13. Er is nu een duidelijke behoefte aan een standaard, eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het construeren van alle soorten tumoren met gecontroleerde groottes.
Vanuit een ander perspectief, hoewel homogene assays en high-content imaging benaderingen zijn ontwikkeld om morfologie, levensvatbaarheid en groeisnelheid te evalueren, blijft de high-throughput screening van 3D-modellen een uitdaging om verschillende redenen die in de literatuur worden gerapporteerd, zoals het gebrek aan uniformiteit in de positie, grootte en morfologie van tumorsferoïden14,15,16.
In het hier gepresenteerde protocol vermelden we elke stap in de constructie van 3D-tumorsferoïden en beschrijven we een methode voor sferoïde observatie en analyse met behulp van een high-throughput, high-content beeldvormingssysteem dat autofocus, auto-imaging en analyse omvat, naast andere voordelige kenmerken. We laten zien hoe deze methode 3D-tumorsferoïden van uniforme grootte kan produceren die geschikt zijn voor high-throughput beeldvorming. Deze sferoïden vertonen ook een hoge gevoeligheid voor de behandeling van kankergeneesmiddelen en morfologische veranderingen in de sferoïden kunnen worden gevolgd met behulp van beeldvorming met een hoog gehalte. Samenvattend tonen we de robuustheid van deze methodologie aan als een middel om 3D-tumorconstructies te genereren voor geneesmiddelenevaluatiedoeleinden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;mL Boil proof microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000&#956;L Pipette tips</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D gel</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>MA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well U bottom Plate</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>P02-48UWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>&#160;DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>W433884-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware&#160;</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware&#160;</td>
			<td>GraphPad software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Content Microscope and SMART system</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>1-I01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin Sol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Fluoroskan Ascent</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>JET Biofil</td>
			<td>TCF012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25% (1X)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies

In de afgelopen decennia zijn, naast monolaag-gekweekte cellen, driedimensionale tumorsferoïden ontwikkeld als een potentieel krachtig hulpmiddel voor de evaluatie van geneesmiddelen tegen kanker. De conventionele kweekmethoden missen echter het vermogen om de tumorsferoïden op een homogene manier op driedimensionaal niveau te manipuleren. Om deze beperking aan te pakken, presenteren we in dit artikel een handige en effectieve methode voor het construeren van tumorsferoïden van gemiddelde grootte. Daarnaast beschrijven we een methode van beeldgebaseerde analyse met behulp van op kunstmatige intelligentie gebaseerde analysesoftware die de hele plaat kan scannen en gegevens over driedimensionale sferoïden kan verkrijgen. Verschillende parameters werden bestudeerd. Door gebruik te maken van een standaardmethode van tumorsferoïde constructie en een high-throughput beeldvormings- en analysesysteem, kunnen de effectiviteit en nauwkeurigheid van medicijntests die worden uitgevoerd op driedimensionale sferoïden drastisch worden verhoogd.

Figuur 1A,B toont het proces dat in deze studie wordt gebruikt voor het construeren van tumorsferoïden. We hebben de cellen eerst gezaaid in een 48-well U-bodemplaat. Deze stap is bijna hetzelfde als die wordt gebruikt in 2D-celcultuur. We bewaarden de plaat in een gemeenschappelijke incubator met water rond de putten, zodat de afgezette cellen sferoïden begonnen te vormen in een zelfassemblageproces. Onder normale operationele omstandigheden werden de meeste soorten tumo...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumorsferoïden. Een strategie voor sferoïde observatie en beeldgebaseerde deep-learning analyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem wordt ook beschreven.

Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Dit protocol demonstreerde een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumoren van sferoïden. En deze methodologie bood een hoog circuit en een hoge inhoudsanalyse van 3D-tumorconstructies. Door gebruik te maken van een standaardmethode van tumorachtige sferoïde constructie en een beeldvormings- en analysesysteem met hoge doorvoer, kunnen de effectiviteit en nauwkeurigheid van medicijntests gevormd op driedimensionale sferoïden drastisch worden verhoogd.In dit protocol gebruikten we AMG510 om NCI-H23 sferoïde als voorbeeld te behandelen. Uit het experiment konden we een significant effect van kankerachtig gericht medicijn op de tumorsferoïden waarnemen. Om te beginnen, pipetteer 100 microliter anti-adhesiereagens in elke put van een 48-putplaat met een U-vormige putbodem en bewaar gedurende 10 minuten.Zuig na 10 minuten het coatingreagens op en was tweemaal met gesteriliseerde PBS. Plaats de kweekplaat in een incubator bij 37 graden Celsius in bevochtigde lucht met 5% koolstofdioxide tot gebruik. Observeer de cellen onder de microscoop.Was vervolgens de cellen gekweekt in een T25-kolf tweemaal met PBS om het kweekmedium te verwijderen en behandel de geëxpandeerde cellen met één milliliter 0,25% trypsine EDTA gedurende één tot twee minuten in een incubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Bevestig de celvorm onder de microscoop. En stop dan de trypsinebehandeling door de gebruikte trypsine EDTA-suspensie in de T25-kolf aan te zuigen en de cellen te wassen met vier milliliter vers medium.Breng alle suspensie over in een buis van 15 milliliter en gebruik één milliliter vers medium om de resterende cellen af te spoelen en aan de buis toe te voegen. Centrifugeer de cellen bij 186,48 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Voeg 10 milliliter vers medium toe aan de celkorrel en pipetteer voorzichtig totdat de cellen zich in een homogene suspensie bevinden.Zuig 0,1 milliliter celsuspensie in een nieuwe centrifugebuis. Voeg 0,9 milliliter vers medium toe en pipetteer de suspensie goed. Extraheer 10 microliter van de celsuspensie voor celtelling.Herhaal dit proces een of twee keer en neem een gemiddelde waarde. Verdun de suspensie tot een uiteindelijke zaaidichtheid van 50.000 cellen per milliliter. Voeg vervolgens 200 microliter van de celsuspensie toe aan elke put van een U-bodemplaat met 48 putten.Wikkel de afdichtingsfolie om de plaat en centrifugeer deze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 119,35 G. Trek na het centrifugeren de beschermende film af en voeg vijf tot acht milliliter gesteriliseerd water toe aan het waterkanaal rond de putten. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende vijf dagen.Verander of vul tijdens deze periode geen water aan het waterkanaal en observeer de celaggregatie gedurende de volgende vijf dagen. Voor de gelinbedding, na het verwijderen van de bevroren gel uit de koelkast van min 20 graden Celsius, plaatst u deze tijdens het experiment de hele tijd op een ijskist. Observeer de celsferoïden onder de microscoop.Voordat de gelinbedding begint, moet de status van de sferoïden opnieuw worden gecontroleerd. Verwijder voorzichtig 150 microliter van het medium en sluit elke sferoïde in de gel in door langzaam de vloeibare gel van de wandzijde van de put toe te voegen terwijl u de voorgekoelde pipetpunt rond en in de put beweegt. Wacht vijf minuten en als de gel zich niet gelijkmatig verspreidt, pipetteer de gel dan voorzichtig met een pipetpunt van 10 microliter.Elke put bevat een tumorsferoïde, 25 microliter van 3,5 milligram per milliliter gel en 50 microliter compleet kweekmedium. Voeg ook 75 microliter medium toe aan de bedieningselementen. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten totdat de hydrogelatie volledig is voltooid.Bevestig de gelatatiestatus onder de microscoop. Bedek 125 microliter vers medium op elk monster en kweek de sferoïden nog eens 7 tot 10 dagen. Bereid groepen sferoïden voor met elk vier tot zes putten en kies er ten minste drie voor analyse.Los het medicijn op volgens de instructies van de fabrikant en bereid 100-voudige werkoplossingen voor met DMSO. Gebruik 0,1% DMSO als positieve controle en voeg 125 microliter met geneesmiddelen behandeld medium toe aan elke put. Plaats de plaat terug in de incubator bij 37 graden Celsius in bevochtigde lucht met 5% koolstofdioxide.In dit stadium bevat elke put een tumorsferoïde, 25 microliter van 3,5 milligram per milliliter gel en 175 microliter van het medium. De controles bevatten 200 microliter van het medium. Meet de levensvatbaarheid van de sferoïde met behulp van een alamarBlue-testkit volgens de richtlijnen van de fabrikant.Zuig 100 microliter van het bovennatuurlijke medium uit elke put naar een nieuwe testplaat. Meet vervolgens de levensvatbaarheid met behulp van een microplaatfotometer. Meet het op dag één, dag vier, dag zeven en dag 10 na het inbedden van de sferoïden in de gel.Voeg 80 microliter vers medium toe aan elke put van de kweekplaat. Vervang vervolgens nog eens 100 microliter van het met geneesmiddelen behandelde medium. Zorg ervoor dat er geen resten van alamarBlue in de put zitten.Zuig 100 microliter van het medium uit voordat u het beeld afgeeft en plaats de plaat op het podium. Verkrijg digitale beelden van de sferoïden met behulp van een geautomatiseerde microscoop met een tienvoudig doel. De microscoop kan deze sferoïden automatisch scherpstellen en centraliseren.Wacht op de automatische beeldvorming. Voor elke sferoïde worden vier beelden verkregen. Een geïntegreerd beeld wordt gevormd en verwerkt met de software die is aangesloten op het high content imaging systeem.Klik op de knop voor het patchproces van afbeeldingen en kies de geïntegreerde afbeeldingen in de software. Kies U net-model en typ de conversieratio. Klik onder aan het scherm om de beeldverwerking te starten.Sla de gegevens over de diameter, omtrek en ruwheid op in de spreadsheetsoftware. Voeg ten slotte 100 microliter vers medium toe aan het medicijn en plaats de plaat terug in de couveuse bij 37 graden Celsius in bevochtigde lucht met 5% koolstofdioxide. De brightfieldbeelden van NCI-H23-celsferoïden die zijn behandeld met verschillende concentraties AMG510 en automatisch worden vastgelegd door een microscoop met een hoog gehalte, worden in deze figuur weergegeven.De kolommen vertegenwoordigen verschillende dagen en de rijen vertegenwoordigen verschillende medicijnconcentraties. De resultaten omvatten drie sferoïden voor elke aandoening. De levensvatbaarheid van tumorsferoïde van de met AMG510 behandelde monstergroepen werd gemeten op dag één, dag vier, dag zeven en dag 10.De terminale cel levensvatbaarheid van de monsters met concentratiegradiënten wordt in deze figuur weergegeven. De tumor sferoïde diameters werden gemeten op dag één, dag vier, dag zeven en dag 10. De sferoïde groeiverhouding werd gedefinieerd als het terminale volume ten opzichte van het oorspronkelijke volume en berekend met behulp van de sferoïde diameters.De sferoïde groeiremmingsverhouding werd gedefinieerd ten opzichte van het volume en berekend met behulp van de sferoïde diameters. De ruwheid van de tumor werd door de software gemeten op dag één, dag vier, dag zeven en dag 10, wat de invasiviteit van de tumorsferoïden aangeeft. De omtrek van de sferoïde werd gelokaliseerd en getekend door de software met behulp van deep learning-algoritmen.De sferoïde gebieden in het brandpuntsvlak werden vervolgens gemeten met afbeelding J en op basis van deze gegevens werd een overtollige perimeterindex berekend. Hoewel dit bericht gemakkelijk te volgen is, moeten de monsters nog steeds zorgvuldig worden behandeld.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Oprichting en karakterisering van de neuro-endocriene tumor Spheroids van de kleine darm

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...