Name: generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

אנו מודים לכל חברי המעבדות שלנו על תרומתם והצעותיהם הקריטיות. מחקר זה נתמך על ידי פרויקט המפתח של ועדת הבריאות של ג'יאנגסו (K2019030). ההמשגה בוצעה על ידי C.W. ו- Z.C., המתודולוגיה בוצעה על ידי W.H. ו- M.L., החקירה בוצעה על ידי W.H. ו- M.L., איסוף הנתונים בוצע על ידי W.H., Z.Z., S.X. ו- M.L., הכנת הטיוטה המקורית בוצעה על ידי Z.Z., J.Z., S.X., W.H., ו-X.L., הסקירה והעריכה בוצעו על ידי Z.C., ניהול הפרויקט בוצע על ידי C.W. ו-Z.C., ורכישת המימון בוצעה על ידי C.W. כל המחברים קראו והסכימו לגרסה שפורסמה של כתב היד.

1. בנייה ספרואידית
<ol><li>טיפול נגד הדבקה של צלחת התרבית<ol><li>פיפטה 100 μL של מגיב נגד הידבקות לתוך כל באר של צלחת 48 באר עם תחתית באר בצורת U, ולשמור במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, שאפו את מגיב הציפוי, ושטפו פעמיים עם PBS מעוקר.</li>
		<li>שים את צלחת התרבית באינקובטור (37 ° C באוויר לח עם 5% CO2) עד לש?...

<ol>
	<li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer.">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li><li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy.">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li><li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-Ts:+New+perspectives+in+cancer+therapy.">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li><li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world.">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li><li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy.">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 116 (2021).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture,+mechanical+loading,+and+real-time+monitoring+of+cells.">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)+ad+reactive+oxygen+species.">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Br&#252;ningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments.">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653 (2020).</li><li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer.">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns,+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models.">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography.">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).</li><li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy.">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition.">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).</li><li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape.">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment:+Cancer+cell+sensing,+mechanobiology+and+metastasis.">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li><li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+KRAS+cancers:+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance.">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).</li><li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy.">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li><li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis.">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li><li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids:+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis.">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li><li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery.">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103 (2016).</li></ol>

המיקרו-סביבה ממלאת תפקיד חשוב בצמיחת הגידול. הוא עשוי להשפיע על מתן מטריצות חוץ-תאיות, שיפועי חמצן, תזונה ואינטראקציה מכנית, ובכך להשפיע על ביטוי גנים, מסלולי אותות ותפקודים רבים של תאי הגידול 19,20,21. במקרים רבים, תאים דו-ממדיים אינם מייצרים...

סרטן הוא אחת המחלות המפחידות ביותר על ידי בני אדם, לא מעט בגלל שיעור התמותה הגבוה שלה1. בשנים האחרונות, האפשרות לטפל בסרטן גדלה כאשר טיפולים חדשים הוכנסו 2,3,4,5. מודלים דו-ממדיים (2D) ותלת ממדיים (3D) במבחנה משמשים לחקר סרטן בתנאי מעבדה. עם זאת, מודלים דו-ממדיים אינם יכולים להעריך באופן מיידי ומדויק את כל הפרמטרים החשובים המצביעים על רגישות אנטי-סרטנית; לכן, הם אינם מייצגים באופן מלא אינטראקציות in vivo בבדיקות טיפול תרופתי6.
מאז 2020, שוק התרבות התלת מימדי (3D) העולמי קיבל דחיפה משמעותית. על פי דיווח אחד של NASDAQ OMX, הערך העולמי של שוק תרביות התאים התלת-ממדיות יעלה על 2.7 מיליארד דולר עד סוף 2025. בהשוואה לשיטות תרבית דו-ממדיות, תרבית תאים תלת-ממדית מציגה תכונות מועילות, שניתן לייעל לא רק להתרבות והתמיינות אלא גם להישרדות ארוכת טווח 7,8. באמצעים כאלה, ניתן לדמות מיקרו-סביבות תאיות in vivo כדי להשיג אפיון מדויק יותר של הגידול, כמו גם פרופיל מטבולי, כך שניתן יהיה להבין טוב יותר שינויים גנומיים וחלבוניים. בשל כך, מערכות בדיקה תלת-ממדיות צריכות להיכלל כעת בפעולות פיתוח תרופות רגילות, במיוחד אלה המתמקדות בסינון והערכה של תרופות אנטי-סרטניות חדשות. גידולים תלת-ממדיים של קווי תאים מבוססים אימורטליים או תרביות תאים ראשוניות במבנים ספרואידים הם בעלי תכונות in vivo של גידולים כגון היפוקסיה וחדירת תרופות, כמו גם אינטראקציה בין תאים, תגובה ועמידות, וניתן לראות בהם מודל מחמיר ומייצג לביצוע בדיקות סקר לתרופות חוץ גופיות 9,10,11.
עם זאת, מודלים אלה של תרבות תלת ממדית סובלים גם ממספר בעיות שעשויות לקחת קצת זמן לפתור. ספרואידים של תאים יכולים להיווצר באמצעות פרוטוקולים אלה, אך הם נבדלים זה מזה בפרטים מסוימים, כגון זמן תרבית או הטמעת ג'לים12, כך שלא ניתן לשלוט היטב בכדורי תאים אלה תחת טווח גודל מוגבל. גודל הספרואידים עשוי להשפיע על עקביות בדיקת הכדאיות וניתוח ההדמיה. מיקרו-סביבות הגדילה וגורמי הגדילה משתנים גם הם, מה שעשוי להוביל למורפולוגיה שונה עקב הבדלים בהתמיינות בין תאים13. כיום יש צורך ברור בשיטה סטנדרטית, פשוטה וחסכונית לבניית כל סוגי הגידולים בגדלים מבוקרים.
מנקודת מבט אחרת, למרות שבדיקות הומוגניות וגישות הדמיה בעלות תוכן גבוה פותחו כדי להעריך מורפולוגיה, כדאיות וקצב צמיחה, הסינון בתפוקה גבוהה של מודלים תלת-ממדיים נותר אתגר מסיבות שונות שדווחו בספרות, כגון חוסר אחידות במיקום, בגודל ובמורפולוגיה של ספרואידים סרטניים14,15,16.
בפרוטוקול המוצג כאן, אנו מפרטים כל שלב בבניית ספרואידים גידוליים תלת-ממדיים ומתארים שיטה לתצפית וניתוח ספרואידים באמצעות מערכת הדמיה בעלת תפוקה גבוהה ותוכן גבוה הכוללת מיקוד אוטומטי, הדמיה אוטומטית וניתוח, בין מאפיינים מועילים אחרים. אנו מראים כיצד שיטה זו יכולה לייצר כדורי גידול תלת-ממדיים בגודל אחיד המתאימים להדמיה בתפוקה גבוהה. ספרואידים אלה מפגינים גם רגישות גבוהה לטיפול תרופתי בסרטן, וניתן לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים בספרואידים באמצעות הדמיה בתוכן גבוה. לסיכום, אנו מדגימים את חוסנה של מתודולוגיה זו כאמצעי ליצירת מבנים תלת-ממדיים של גידולים למטרות הערכת תרופות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;mL Boil proof microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000&#956;L Pipette tips</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D gel</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>MA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well U bottom Plate</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>P02-48UWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>&#160;DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>W433884-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware&#160;</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware&#160;</td>
			<td>GraphPad software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Content Microscope and SMART system</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>1-I01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin Sol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Fluoroskan Ascent</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>JET Biofil</td>
			<td>TCF012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25% (1X)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies

בעשורים האחרונים, בנוסף לתאים חד-שכבתיים, פותחו ספרואידים סרטניים תלת-ממדיים ככלי רב עוצמה פוטנציאלי להערכת תרופות אנטי-סרטניות. עם זאת, שיטות התרבית הקונבנציונליות חסרות את היכולת לתפעל את ספרואידים הגידול באופן הומוגני ברמה התלת מימדית. כדי להתמודד עם מגבלה זו, במאמר זה, אנו מציגים שיטה נוחה ויעילה לבניית ספרואידים סרטניים בגודל ממוצע. בנוסף, אנו מתארים שיטה של ניתוח מבוסס תמונה באמצעות תוכנת ניתוח מבוססת בינה מלאכותית שיכולה לסרוק את כל הצלחת ולקבל נתונים על ספרואידים תלת מימדיים. נבדקו מספר פרמטרים. על ידי שימוש בשיטה סטנדרטית של בניית ספרואידים סרטניים ומערכת הדמיה וניתוח בתפוקה גבוהה, ניתן להגדיל באופן דרמטי את היעילות והדיוק של בדיקות תרופתיות המבוצעות על ספרואידים תלת מימדיים.

איור 1A,B מראה במחקר זה את התהליך המשמש לבניית ספרואידים סרטניים. תחילה זרענו את התאים בצלחת U-bottom בעלת 48 בארות. שלב זה כמעט זהה לזה המשמש בתרבית תאים דו-ממדית. שמרנו את הצלחת באינקובטור משותף עם מים המקיפים את הבארות, כך שהתאים שהושקעו החלו ליצור ספרואידים בתהליך הר?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לבניית ספרואידים תלת מימדיים של גידולים. כמו כן מתוארת אסטרטגיה לתצפית ספרואידית וניתוח למידה עמוקה מבוססת תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

פרוטוקול זה הדגים שיטה סטנדרטית לבניית גידולים תלת מימדיים של ספרואידים. ומתודולוגיה זו סיפקה ניתוח מעגל גבוה ותוכן גבוה של מבני גידול תלת ממדיים. על ידי שימוש בשיטה סטנדרטית של בניית ספרואידים סרטניים ומערכת הדמיה וניתוח בתפוקה גבוהה, ניתן להגדיל באופן דרמטי את היעילות והדיוק של בדיקות סמים שנוצרו על ספרואידים תלת מימדיים.בפרוטוקול זה, השתמשנו ב- AMG510 לטיפול בספרואיד NCI-H23 כדוגמה. מהניסוי יכולנו לראות השפעה משמעותית של תרופה סרטנית ממוקדת מטרה על ספרואידים סרטניים. כדי להתחיל, פיפטה 100 מיקרוליטר של מגיב אנטי הידבקות לתוך כל באר של צלחת 48 באר עם תחתית באר בצורת U ולשמור במשך 10 דקות.לאחר 10 דקות, שאפו את מגיב הציפוי ושטפו פעמיים עם PBS מעוקר. הניחו את צלחת התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באוויר לח עם 5% פחמן דו חמצני עד לשימוש. התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ.לאחר מכן, שטפו את התאים בתרבית בבקבוק T25 פעמיים עם PBS כדי להסיר את מדיום התרבית ולטפל בתאים המורחבים עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA למשך דקה עד שתיים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. אשר את צורת התא מתחת למיקרוסקופ. ואז להפסיק את הטיפול טריפסין על ידי שאיפת ההשעיה בשימוש טריפסין EDTA בבקבוק T25 ושטיפת התאים עם ארבעה מיליליטר של מדיום טרי.מעבירים את כל התרחיף לצינור של 15 מיליליטר ומשתמשים במיליליטר אחד של מדיום טרי כדי לשטוף את התאים השיוריים ולהוסיף אותו לצינור. צנטריפוגו את התאים בטמפרטורה של 186.48 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנטנט. מוסיפים 10 מיליליטר של מדיום טרי לכדורית התא ופיפטה עדינה עד שהתאים נמצאים בתרחיף הומוגני.שאפו 0.1 מיליליטר של תרחיף תאים לתוך צינור צנטריפוגה חדש. מוסיפים 0.9 מיליליטר של מדיום טרי ולאחר מכן פיפטה את ההשעיה היטב. לחלץ 10 מיקרוליטר של תרחיף התא לספירת תאים.חזור על תהליך זה פעם או פעמיים וקבל ערך ממוצע. לדלל את ההשעיה כדי להגיע לצפיפות זריעה סופית של 50, 000 תאים למיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 200 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת 48 באר U-תחתית.עוטפים את סרט האיטום סביב הצלחת וצנטריפוגות אותו בטמפרטורה של 119.35 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, משוך את סרט המגן והוסף חמישה עד שמונה מיליליטר מים מעוקרים לתעלת המים המקיפה את הבארות. דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים.אין להחליף או להוסיף מים לתעלת המים במהלך תקופה זו ולצפות בצבירת התאים במהלך חמשת הימים הבאים. להטמעת הג'ל, לאחר הוצאת הג'ל הקפוא מהמקרר במינוס 20 מעלות צלזיוס, מניחים אותו על קופסת קרח למשך כל הזמן במהלך הניסוי. התבוננו בכדורי התא מתחת למיקרוסקופ.לפני תחילת הטבעה בג'ל, יש לבדוק שוב את מצב הספרואידים. בזהירות להסיר 150 מיקרוליטר של המדיום ולהטמיע כל spheroid בג'ל על ידי הוספה איטית של ג'ל נוזלי מצד הקיר של הבאר תוך הזזת קצה פיפטה מקורר מראש סביב ובתוך הבאר. המתן חמש דקות ואם הג'ל אינו מתפשט באופן שווה, פיפטה בעדינות את הג'ל עם קצה פיפטה 10 מיקרוליטר.כל באר מכילה ספרואיד גידולי, 25 מיקרוליטר של 3.5 מיליגרם למיליליטר ג'ל, ו-50 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם. הוסף 75 מיקרוליטר של בינוני לבקרות גם כן. לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד hydrogelation הושלם במלואו.אשר את מצב הג'לציה מתחת למיקרוסקופ. שכבו 125 מיקרוליטר של מדיום טרי על כל דגימה ותרבו את הספרואידים למשך 7 עד 10 ימים נוספים. הכינו קבוצות של ספרואידים עם ארבע עד שש בארות כל אחת ובחרו לפחות שלוש מהן לניתוח.להמיס את התרופה על פי הוראות היצרן ולהכין 100 פעמים פתרונות עבודה עם DMSO. השתמש 0.1% DMSO כבקרה חיובית ולהוסיף 125 מיקרוליטר של מדיום מטופל בתרופות לכל באר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באוויר לח עם 5% פחמן דו חמצני.בשלב זה, כל באר מכילה ספרואיד גידול, 25 מיקרוליטר של 3.5 מיליגרם לג'ל מיליליטר, ו 175 מיקרוליטר של המדיום. הפקדים מכילים 200 מיקרוליטר של המדיום. מדוד את הכדאיות הספרואיד באמצעות ערכת בדיקה alamarBlue בהתאם להנחיות היצרן.שאפו 100 מיקרוליטר של התווך הסופרנאטנטי מכל באר לצלחת בדיקה חדשה. לאחר מכן, למדוד את הכדאיות באמצעות פוטומטר microplate. מדדו אותו ביום הראשון, ביום הרביעי, ביום השביעי וביום העשירי לאחר הטמעת הספרואידים בג'ל.מוסיפים 80 מיקרוליטר של מדיום טרי לכל באר של צלחת התרבית. לאחר מכן להחליף עוד 100 מיקרוליטר של המדיום המטופל בתרופה. ודאו שאין שרידים של אלמר בלו בבאר.שאפו החוצה 100 מיקרוליטר של המדיום לפני ההדמיה והניחו את הצלחת על הבמה. קבל תמונות דיגיטליות של הספרואידים באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי עם מטרה פי עשרה. המיקרוסקופ יכול למקד ולרכז את הספרואידים הללו באופן אוטומטי.המתן להדמיה האוטומטית. ארבע תמונות נרכשות עבור כל ספרואיד. תמונה משולבת נוצרת ומעובדת עם התוכנה המחוברת למערכת הדמיה תוכן גבוה.לחץ על כפתור תהליך תיקון התמונה ובחר את התמונות המשולבות בתוכנה. בחר דגם U net והקלד את יחס ההמרה. לחץ בתחתית המסך כדי להתחיל בעיבוד התמונה.שמור את נתוני הקוטר, ההיקף והחספוס בתוכנת הגיליון האלקטרוני. לבסוף, להוסיף 100 מיקרוליטר של מדיום טרי עם התרופה ומניחים את הצלחת בחזרה לתוך האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס באוויר לח עם 5% פחמן דו חמצני. תמונות שדה בהיר של ספרואידים של תאי NCI-H23 שטופלו בריכוזים שונים של AMG510 ונלכדו אוטומטית על ידי מיקרוסקופ בעל תוכן גבוה מוצגות באיור זה.העמודות מייצגות ימים שונים והשורות מייצגות ריכוזי תרופות שונים. התוצאות כוללות שלושה ספרואידים לכל מצב. כדאיות הגידול של קבוצות הדגימה שטופלו ב-AMG510 נמדדה ביום הראשון, ביום הרביעי, ביום השביעי וביום העשירי.כדאיות התא הסופי של הדגימות עם שיפועי ריכוז מוצגת באיור זה. קוטר כדורי הגידול נמדד ביום הראשון, ביום הרביעי, ביום השביעי וביום העשירי. יחס הגידול הספרואידי הוגדר כנפח הסופי ביחס לנפח המקורי וחושב באמצעות קוטר הספרואידים.יחס עיכוב הצמיחה הספרואידי הוגדר ביחס לנפח וחושב באמצעות קוטר הספרואידים. חספוס הגידול נמדד על ידי התוכנה ביום הראשון, ביום הרביעי, ביום השביעי וביום העשירי, מה שמצביע על הפולשנות של כדורי הגידול. היקף הספרואיד אותר ושורטט על ידי התוכנה באמצעות אלגוריתמים של למידה עמוקה.האזורים הכדוריים במישור המוקד נמדדו אז על ידי תמונה J ומדד היקפי עודף חושב על סמך נתונים אלה. למרות שקל לעקוב אחר הודעה זו, עדיין יש לטפל בדגימות בזהירות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In vivo מודל השפעת בדיקה של היפוקסיה על גרורות של גידולים

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

הקמה ואפיון של המעי הקטן נוירואנדוקרינים הגידול האנדוקרינית

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

סטרומה הרומן פיברוהפיצוץ-מודנן 3D הגידול מודל ספרואיד ללמוד אינטראקציה סרטניים-סטרומה וגילוי הסמים

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...