Denne protokollen demonstrerte en standardisert metode for å konstruere tredimensjonale svulster av sfæroider. Og denne metoden ga en høykrets og høy innholdsanalyse av 3D-tumorkonstruksjoner. Ved å bruke en standardmetode for tumorøs sfæroidkonstruksjon og et høyt gjennomstrømningsbildebehandlings- og analysesystem, kan effektiviteten og nøyaktigheten av legemiddeltester dannet på tredimensjonale sfæroider økes dramatisk.
I denne protokollen brukte vi AMG510 til å behandle NCI-H23 sfæroid som et eksempel. Fra forsøket kunne vi observere en signifikant effekt av kreftmålrettet legemiddel på tumorsfæroidene. For å begynne, pipette 100 mikroliter anti-adhesjonsreagens i hver brønn på en 48 brønnplate med en U-formet brønnbunn og hold i 10 minutter.
Etter 10 minutter, aspirer beleggreagenset og vask to ganger med sterilisert PBS. Plasser kulturplaten i en inkubator ved 37 grader Celsius i fuktet luft med 5% karbondioksid til bruk. Observer cellene under mikroskopet.
Deretter vasker du cellene dyrket i en T25-kolbe to ganger med PBS for å fjerne kulturmediet og behandle de utvidede cellene med en milliliter 0,25% trypsin EDTA i ett til to minutter i en inkubator ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid. Bekreft celleformen under mikroskopet. Og så stoppe trypsinbehandlingen ved å aspirere den brukte trypsin EDTA-suspensjonen i T25-kolben og vaske cellene med fire milliliter friskt medium.
Overfør all suspensjonen til et 15 milliliter rør og bruk en milliliter friskt medium for å vaske ned de resterende cellene og legge det til røret. Sentrifuger cellene ved 186,48 G i fem minutter ved romtemperatur og kast supernatanten. Tilsett 10 ml friskt medium til cellepelleten og pipett forsiktig til cellene er i en homogen suspensjon.
Aspirer 0,1 ml cellesuspensjon i et nytt sentrifugerør. Tilsett 0,9 ml friskt medium og deretter pipette suspensjonen godt. Trekk ut 10 mikroliter av cellesuspensjonen for celletelling.
Gjenta denne prosessen en eller to ganger og ta en gjennomsnittsverdi. Fortynn suspensjonen for å nå en endelig såtetthet på 50.000 celler per milliliter. Deretter tilsettes 200 mikroliter av cellesuspensjonen til hver brønn på en 48 brønn U-bunnplate.
Pakk tetningsfilmen rundt platen og sentrifuge den ved 119,35 G i fem minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering, trekk av beskyttelsesfilmen og tilsett fem til åtte milliliter sterilisert vann i vannkanalen som omgir brønnene. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i fem dager.
Ikke bytt eller tilsett vann til vannkanalen i denne perioden, og observer celleaggregeringen i løpet av de følgende fem dagene. For gelinnbyggingen, etter å ha tatt ut den frosne gelen fra minus 20 grader Celsius-kjøleskapet, legg den på en isboks hele tiden under forsøket. Vær oppmerksom på cellesfæroidene under mikroskopet.
Før gelinnbindingen begynner, bør statusen til sfæroidene igjen kontrolleres. Fjern forsiktig 150 mikroliter av mediet og legg inn hver sfæroid i gelen ved sakte å tilsette væskegelen fra veggsiden av brønnen mens du beveger den forkjølte pipettespissen rundt og inne i brønnen. Vent i fem minutter, og hvis gelen ikke sprer seg jevnt, pipetter du forsiktig gelen med en 10 mikroliter pipettespiss.
Hver brønn inneholder en tumor sfæroid, 25 mikroliter 3, 5 milligram per milliliter gel og 50 mikroliter komplett kulturmedium. Legg til 75 mikroliter medium til kontrollene også. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 30 minutter til hydrogeleringen er fullført.
Bekreft geleringsstatusen under mikroskopet. Legg 125 mikroliter friskt medium på hver prøve og dyrk sfæroidene i ytterligere 7 til 10 dager. Forbered grupper av sfæroider med fire til seks brønner hver og velg minst tre av dem for analyse.
Oppløs stoffet i henhold til produsentens instruksjoner og lag 100 ganger arbeidsløsninger med DMSO. Bruk 0,1% DMSO som en positiv kontroll og tilsett 125 mikroliter medikamentbehandlet medium til hver brønn. Plasser platen tilbake i inkubatoren ved 37 grader Celsius i fuktet luft med 5% karbondioksid.
På dette stadiet inneholder hver brønn en tumor sfæroid, 25 mikroliter 3, 5 milligram per milliliter gel og 175 mikroliter av mediet. Kontrollene inneholder 200 mikroliter av mediet. Mål sfæroidens levedyktighet ved hjelp av et alamarBlue-analysesett i henhold til produsentens retningslinjer.
Aspirer 100 mikroliter av supernatantmediet fra hver brønn til en ny testplate. Deretter måler du levedyktigheten ved hjelp av et mikroplatefotometer. Mål det på dag én, dag fire, dag syv og dag 10 etter å ha lagt inn sfæroidene i gelen.
Tilsett 80 mikroliter friskt medium til hver brønn på kulturplaten. Deretter erstattes ytterligere 100 mikroliter av det legemiddelbehandlede mediet. Forsikre deg om at det ikke er rester av alamarBlue i brønnen.
Aspirer 100 mikroliter av mediet ut før avbildning og legg platen på scenen. Få digitale bilder av sfæroidene ved hjelp av et automatisert mikroskop med et tidobbelt mål. Mikroskopet kan fokusere og sentralisere disse sfæroidene automatisk.
Vent på automatisk bildebehandling. Fire bilder er anskaffet for hver sfæroid. Et integrert bilde dannes og behandles med programvaren som er koblet til bildebehandlingssystemet med høyt innhold.
Klikk på bildeoppdateringsprosessknappen og velg de integrerte bildene i programvaren. Velg U nettomodell og skriv inn konverteringsfrekvensen. Klikk nederst på skjermen for å starte bildebehandlingen.
Lagre diameter-, perimeter- og ruhetsdata i regnearkprogramvaren. Til slutt tilsettes 100 mikroliter friskt medium med stoffet og legger platen tilbake i inkubatoren ved 37 grader Celsius i fuktet luft med 5% karbondioksid. Lysfeltbildene av NCI-H23-cellesfæroider behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AMG510 og automatisk fanget av et mikroskop med høyt innhold er vist i denne figuren.
Kolonnene representerer forskjellige dager, og radene representerer forskjellige legemiddelkonsentrasjoner. Resultatene inkluderer tre sfæroider for hver tilstand. Tumor spheroid levedyktighet av AMG510 behandlede prøvegrupper ble målt på dag én, dag fire, dag syv og dag 10.
Den terminale cellelevedyktigheten til prøvene med konsentrasjonsgradienter er vist i denne figuren. Tumorsfæroiddiametrene ble målt på dag én, dag fire, dag syv og dag 10. Det sfæroide vekstforholdet ble definert som terminalvolumet i forhold til det opprinnelige volumet og beregnet ved hjelp av sfæroiddiametre.
Det sfæroide veksthemmingsforholdet ble definert i forhold til volumet og beregnet ved hjelp av sfæroiddiametre. Tumorruheten ble målt av programvaren på dag én, dag fire, dag syv og dag 10, noe som indikerer invasiviteten til tumorsfæroidene. Sfæroidens omkrets ble lokalisert og tegnet av programvaren ved hjelp av dype læringsalgoritmer.
De sfæroide områdene i fokalplanet ble deretter målt ved bilde J og en overflødig perimeterindeks ble beregnet basert på disse dataene. Selv om denne meldingen er enkel å følge, må prøvene fortsatt håndteres nøye.