Name: generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

Vi takker alle medlemmer av våre laboratorier for deres kritiske innspill og forslag. Denne forskningen ble støttet av Key Project of Jiangsu Commission of Health (K2019030). Konseptualisering ble utført av CW og Z.C., metodikken ble utført av W.H. og M.L., undersøkelsen ble utført av W.H. og M.L., datakurateringen ble utført av W.H., Z.Z., S.X. og M.L., det opprinnelige utkastet ble utført av Z.Z., J.Z., S.X., W.H., og X.L., gjennomgangen og redigeringen ble utført av Z.C., prosjektadministrasjonen ble utført av C.W. og Z.C., og finansieringsanskaffelsen ble utført av C.W. Alle forfatterne har lest og samtykket til den publiserte versjonen av manuskriptet.

1. Sfæroid konstruksjon
<ol><li>Anti-adhesjonsbehandling av kulturplaten<ol><li>Pipette 100 μL anti-adhesjonsreagens i hver brønn i en 48-brønnplate med en U-formet brønnbunn, og hold i 10 minutter. Etter 10 minutter, aspirer beleggreagenset, og vask to ganger med sterilisert PBS.</li>
		<li>Sett dyrkningsplaten i en inkubator (37 °C i fuktet luft med 5 % CO2) til bruk.</li>
	</ol></li>
	<li>Celleforberedelse, innsamling og telling<ol><li>Bruk det dyrkningsmediet som er spesifikt for c...

<ol>
	<li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer.">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li><li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy.">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li><li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-Ts:+New+perspectives+in+cancer+therapy.">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li><li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world.">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li><li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy.">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 116 (2021).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture,+mechanical+loading,+and+real-time+monitoring+of+cells.">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)+ad+reactive+oxygen+species.">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Br&#252;ningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments.">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653 (2020).</li><li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer.">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns,+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models.">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography.">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).</li><li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy.">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition.">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).</li><li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape.">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment:+Cancer+cell+sensing,+mechanobiology+and+metastasis.">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li><li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+KRAS+cancers:+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance.">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).</li><li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy.">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li><li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis.">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li><li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids:+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis.">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li><li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery.">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103 (2016).</li></ol>

Mikromiljøet spiller en viktig rolle i tumorvekst. Det kan påvirke tilførselen av ekstracellulære matriser, oksygengradienter, ernæring og mekanisk interaksjon og dermed påvirke genuttrykk, signalveier og mange funksjoner i tumorceller 19,20,21. I mange tilfeller produserer 2D-celler ikke slike effekter eller til og med produserer motsatte effekter, og påvirker dermed evalueringen av medikamentelle behandlinger. Fremvekst...

Kreft er en av de sykdommene mennesker frykter mest, ikke minst på grunn av den høye dødeligheten1. De siste årene har muligheten for å behandle kreft økt etter hvert som nye terapier har blitt introdusert 2,3,4,5. Todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) in vitro-modeller brukes til å studere kreft i laboratorieinnstilling. Imidlertid kan 2D-modeller ikke umiddelbart og nøyaktig vurdere alle viktige parametere som indikerer antitumorfølsomhet; Derfor klarer de ikke fullt ut å representere in vivo-interaksjoner i medisineringstesting6.
Siden 2020 har det globale tredimensjonale (3D) kulturmarkedet blitt kraftig styrket. Ifølge en rapport fra NASDAQ OMX vil den globale verdien av 3D-cellekulturmarkedet overstige USD 2,7 milliarder innen utgangen av 2025. Sammenlignet med 2D-kulturmetoder viser 3D-celledyrking fordelaktige egenskaper, som kan optimaliseres ikke bare for spredning og differensiering, men også for langsiktig overlevelse 7,8. På denne måten kan in vivo cellulære mikromiljøer simuleres for å oppnå mer nøyaktig tumorkarakterisering, samt metabolsk profilering, slik at genomiske og proteinendringer kan forstås bedre. På grunn av dette bør 3D-testsystemer nå inkluderes i vanlige legemiddelutviklingsoperasjoner, spesielt de med fokus på screening og evaluering av nye antitumormedisiner. Tredimensjonale vekster av immortaliserte etablerte cellelinjer eller primære cellekulturer i sfæroide strukturer har in vivo egenskaper av svulster som hypoksi og medikamentpenetrasjon, samt celleinteraksjon, respons og motstand, og kan betraktes som en streng og representativ modell for å utføre in vitro legemiddelscreening 9,10,11.
Imidlertid lider disse 3D-kulturmodellene også av flere problemer som kan ta litt tid å løse. Cellesfæroider kan dannes ved hjelp av disse protokollene, men de varierer i visse detaljer, for eksempel kulturtid eller innebygging av geler12, slik at disse konstruerte cellesfæroider ikke kan kontrolleres godt under et begrenset størrelsesområde. Størrelsen på sfæroidene kan påvirke konsistensen av levedyktighetstesten og bildeanalysen. Vekstmikromiljøene og vekstfaktorene varierer også, noe som kan føre til forskjellige morfologier på grunn av forskjeller i differensieringen mellom celler13. Det er nå et åpenbart behov for en standard, enkel og kostnadseffektiv metode for å konstruere alle typer svulster med kontrollerte størrelser.
Fra et annet perspektiv, selv om homogene analyser og bildebehandlingsmetoder med høyt innhold er utviklet for å evaluere morfologi, levedyktighet og veksthastighet, er screening av 3D-modeller med høy gjennomstrømning fortsatt en utfordring av ulike grunner rapportert i litteraturen, for eksempel mangelen på ensartethet i posisjonen, størrelsen og morfologien til tumorsfæroider14,15,16.
I protokollen som presenteres her, lister vi hvert trinn i konstruksjonen av 3D-tumorsfæroider og beskriver en metode for sfæroidobservasjon og analyse ved hjelp av et bildebehandlingssystem med høy gjennomstrømning og høyt innhold som involverer autofokus, autoavbildning og analyse, blant andre fordelaktige egenskaper. Vi viser hvordan denne metoden kan produsere 3D-tumor sfæroider av ensartet størrelse som er egnet for høy gjennomstrømningsavbildning. Disse sfæroidene viser også høy følsomhet for kreftbehandling, og morfologiske endringer i sfæroidene kan overvåkes ved hjelp av bildebehandling med høyt innhold. Oppsummert demonstrerer vi robustheten til denne metoden som et middel til å generere 3D-tumorkonstruksjoner for legemiddelevalueringsformål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;mL Boil proof microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000&#956;L Pipette tips</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D gel</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>MA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well U bottom Plate</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>P02-48UWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>&#160;DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>W433884-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware&#160;</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware&#160;</td>
			<td>GraphPad software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Content Microscope and SMART system</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>1-I01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin Sol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Fluoroskan Ascent</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>JET Biofil</td>
			<td>TCF012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25% (1X)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies

I de siste tiårene, i tillegg til monolayer-kulturerte celler, har tredimensjonale tumor sfæroider blitt utviklet som et potensielt kraftig verktøy for evaluering av kreftmedisiner. Imidlertid mangler de konvensjonelle kulturmetodene evnen til å manipulere tumorsfæroidene på en homogen måte på tredimensjonalt nivå. For å løse denne begrensningen, presenterer vi i dette papiret en praktisk og effektiv metode for å konstruere gjennomsnittlig størrelse tumor sfæroider. I tillegg beskriver vi en metode for bildebasert analyse ved hjelp av kunstig intelligens-basert analyseprogramvare som kan skanne hele platen og få data på tredimensjonale sfæroider. Flere parametere ble studert. Ved å bruke en standardmetode for tumorsfæroidkonstruksjon og et bildebehandlings- og analysesystem med høy gjennomstrømning, kan effektiviteten og nøyaktigheten av legemiddeltester utført på tredimensjonale sfæroider økes dramatisk.

Figur 1A,B viser prosessen som ble brukt for å konstruere tumorsfæroider i denne studien. Vi sådde først cellene i en 48-brønns U-bunnplate. Dette trinnet er nesten det samme som brukes i 2D-cellekultur. Vi oppbevarte platen i en felles inkubator med vann rundt brønnene, slik at de avsatte cellene begynte å danne sfæroider i en selvmonteringsprosess. Under normale driftsforhold ble de fleste typer tumorsfæroider fullstendig dannet etter 5 dager når et målrettet m...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Denne artikkelen demonstrerer en standardisert metode for konstruksjon av tredimensjonale tumorsfæroider. En strategi for sfæroidobservasjon og bildebasert dyplæringsanalyse ved hjelp av et automatisert bildesystem er også beskrevet.

Generering av 3D-tumorsfæroider for legemiddelevalueringsstudier

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Denne protokollen demonstrerte en standardisert metode for å konstruere tredimensjonale svulster av sfæroider. Og denne metoden ga en høykrets og høy innholdsanalyse av 3D-tumorkonstruksjoner. Ved å bruke en standardmetode for tumorøs sfæroidkonstruksjon og et høyt gjennomstrømningsbildebehandlings- og analysesystem, kan effektiviteten og nøyaktigheten av legemiddeltester dannet på tredimensjonale sfæroider økes dramatisk.I denne protokollen brukte vi AMG510 til å behandle NCI-H23 sfæroid som et eksempel. Fra forsøket kunne vi observere en signifikant effekt av kreftmålrettet legemiddel på tumorsfæroidene. For å begynne, pipette 100 mikroliter anti-adhesjonsreagens i hver brønn på en 48 brønnplate med en U-formet brønnbunn og hold i 10 minutter.Etter 10 minutter, aspirer beleggreagenset og vask to ganger med sterilisert PBS. Plasser kulturplaten i en inkubator ved 37 grader Celsius i fuktet luft med 5% karbondioksid til bruk. Observer cellene under mikroskopet.Deretter vasker du cellene dyrket i en T25-kolbe to ganger med PBS for å fjerne kulturmediet og behandle de utvidede cellene med en milliliter 0,25% trypsin EDTA i ett til to minutter i en inkubator ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid. Bekreft celleformen under mikroskopet. Og så stoppe trypsinbehandlingen ved å aspirere den brukte trypsin EDTA-suspensjonen i T25-kolben og vaske cellene med fire milliliter friskt medium.Overfør all suspensjonen til et 15 milliliter rør og bruk en milliliter friskt medium for å vaske ned de resterende cellene og legge det til røret. Sentrifuger cellene ved 186,48 G i fem minutter ved romtemperatur og kast supernatanten. Tilsett 10 ml friskt medium til cellepelleten og pipett forsiktig til cellene er i en homogen suspensjon.Aspirer 0,1 ml cellesuspensjon i et nytt sentrifugerør. Tilsett 0,9 ml friskt medium og deretter pipette suspensjonen godt. Trekk ut 10 mikroliter av cellesuspensjonen for celletelling.Gjenta denne prosessen en eller to ganger og ta en gjennomsnittsverdi. Fortynn suspensjonen for å nå en endelig såtetthet på 50.000 celler per milliliter. Deretter tilsettes 200 mikroliter av cellesuspensjonen til hver brønn på en 48 brønn U-bunnplate.Pakk tetningsfilmen rundt platen og sentrifuge den ved 119,35 G i fem minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering, trekk av beskyttelsesfilmen og tilsett fem til åtte milliliter sterilisert vann i vannkanalen som omgir brønnene. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i fem dager.Ikke bytt eller tilsett vann til vannkanalen i denne perioden, og observer celleaggregeringen i løpet av de følgende fem dagene. For gelinnbyggingen, etter å ha tatt ut den frosne gelen fra minus 20 grader Celsius-kjøleskapet, legg den på en isboks hele tiden under forsøket. Vær oppmerksom på cellesfæroidene under mikroskopet.Før gelinnbindingen begynner, bør statusen til sfæroidene igjen kontrolleres. Fjern forsiktig 150 mikroliter av mediet og legg inn hver sfæroid i gelen ved sakte å tilsette væskegelen fra veggsiden av brønnen mens du beveger den forkjølte pipettespissen rundt og inne i brønnen. Vent i fem minutter, og hvis gelen ikke sprer seg jevnt, pipetter du forsiktig gelen med en 10 mikroliter pipettespiss.Hver brønn inneholder en tumor sfæroid, 25 mikroliter 3, 5 milligram per milliliter gel og 50 mikroliter komplett kulturmedium. Legg til 75 mikroliter medium til kontrollene også. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 30 minutter til hydrogeleringen er fullført.Bekreft geleringsstatusen under mikroskopet. Legg 125 mikroliter friskt medium på hver prøve og dyrk sfæroidene i ytterligere 7 til 10 dager. Forbered grupper av sfæroider med fire til seks brønner hver og velg minst tre av dem for analyse.Oppløs stoffet i henhold til produsentens instruksjoner og lag 100 ganger arbeidsløsninger med DMSO. Bruk 0,1% DMSO som en positiv kontroll og tilsett 125 mikroliter medikamentbehandlet medium til hver brønn. Plasser platen tilbake i inkubatoren ved 37 grader Celsius i fuktet luft med 5% karbondioksid.På dette stadiet inneholder hver brønn en tumor sfæroid, 25 mikroliter 3, 5 milligram per milliliter gel og 175 mikroliter av mediet. Kontrollene inneholder 200 mikroliter av mediet. Mål sfæroidens levedyktighet ved hjelp av et alamarBlue-analysesett i henhold til produsentens retningslinjer.Aspirer 100 mikroliter av supernatantmediet fra hver brønn til en ny testplate. Deretter måler du levedyktigheten ved hjelp av et mikroplatefotometer. Mål det på dag én, dag fire, dag syv og dag 10 etter å ha lagt inn sfæroidene i gelen.Tilsett 80 mikroliter friskt medium til hver brønn på kulturplaten. Deretter erstattes ytterligere 100 mikroliter av det legemiddelbehandlede mediet. Forsikre deg om at det ikke er rester av alamarBlue i brønnen.Aspirer 100 mikroliter av mediet ut før avbildning og legg platen på scenen. Få digitale bilder av sfæroidene ved hjelp av et automatisert mikroskop med et tidobbelt mål. Mikroskopet kan fokusere og sentralisere disse sfæroidene automatisk.Vent på automatisk bildebehandling. Fire bilder er anskaffet for hver sfæroid. Et integrert bilde dannes og behandles med programvaren som er koblet til bildebehandlingssystemet med høyt innhold.Klikk på bildeoppdateringsprosessknappen og velg de integrerte bildene i programvaren. Velg U nettomodell og skriv inn konverteringsfrekvensen. Klikk nederst på skjermen for å starte bildebehandlingen.Lagre diameter-, perimeter- og ruhetsdata i regnearkprogramvaren. Til slutt tilsettes 100 mikroliter friskt medium med stoffet og legger platen tilbake i inkubatoren ved 37 grader Celsius i fuktet luft med 5% karbondioksid. Lysfeltbildene av NCI-H23-cellesfæroider behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AMG510 og automatisk fanget av et mikroskop med høyt innhold er vist i denne figuren.Kolonnene representerer forskjellige dager, og radene representerer forskjellige legemiddelkonsentrasjoner. Resultatene inkluderer tre sfæroider for hver tilstand. Tumor spheroid levedyktighet av AMG510 behandlede prøvegrupper ble målt på dag én, dag fire, dag syv og dag 10.Den terminale cellelevedyktigheten til prøvene med konsentrasjonsgradienter er vist i denne figuren. Tumorsfæroiddiametrene ble målt på dag én, dag fire, dag syv og dag 10. Det sfæroide vekstforholdet ble definert som terminalvolumet i forhold til det opprinnelige volumet og beregnet ved hjelp av sfæroiddiametre.Det sfæroide veksthemmingsforholdet ble definert i forhold til volumet og beregnet ved hjelp av sfæroiddiametre. Tumorruheten ble målt av programvaren på dag én, dag fire, dag syv og dag 10, noe som indikerer invasiviteten til tumorsfæroidene. Sfæroidens omkrets ble lokalisert og tegnet av programvaren ved hjelp av dype læringsalgoritmer.De sfæroide områdene i fokalplanet ble deretter målt ved bilde J og en overflødig perimeterindeks ble beregnet basert på disse dataene. Selv om denne meldingen er enkel å følge, må prøvene fortsatt håndteres nøye.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In vivo modell for testing Effekt av hypoksi på tumormetastaser

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses for svulst målrettede Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Langsgående morfologiske og fysiologiske overvåking av tredimensjonale svulst Spheroids bruker Optical Coherence tomografi

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering av små tarm Nevroendokrine tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Modulert 3D Tumor Sfæroid Modell for å studere tumor-Stroma interaksjon og narkotika oppdagelse

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...