Name: generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies
Uploaded: 2023-02-24T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

Laboratuvarlarımızın tüm üyelerine eleştirel katkı ve önerileri için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Jiangsu Sağlık Komisyonu Anahtar Projesi (K2019030) tarafından desteklenmiştir. Kavramsallaştırma C.W. ve Z.C. tarafından, metodoloji W.H. ve M.L. tarafından, araştırma W.H. ve M.L. tarafından, veri kürasyonu W.H., Z.Z., S.X. ve M.L. tarafından, orijinal taslak hazırlığı Z.Z., J.Z., S.X., W.H. tarafından gerçekleştirilmiştir. ve X.L., inceleme ve düzenleme Z.C. tarafından, proje yönetimi C.W. ve Z.C. tarafından gerçekleştirilmiş ve finansman alımı C.W. tarafından gerçekleştirilmiştir. Tüm yazarlar makalenin yayınlanmış versiyonunu okumuş ve kabul etmişlerdir.

1. Küresel yapı
<ol><li>Kültür plağının yapışma önleyici tedavisi<ol><li>U şeklinde kuyu tabanına sahip 48 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL yapışma önleyici reaktif pipet edin ve 10 dakika bekletin. 10 dakika sonra, kaplama reaktifini aspire edin ve sterilize edilmiş PBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Kültür plakasını kullanıma kadar bir inkübatöre (% 5 CO2 ile nemlendirilmiş havada 37 ° C) koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre hazırlama, toplama v...

<ol>
	<li>Carioli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+cancer+mortality+predictions+for+the+year+2021+with+focus+on+pancreatic+and+female+lung+cancer.">European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer.</a> Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).</li><li>Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+cancer+biology+and+therapy.">CRISPR in cancer biology and therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).</li><li>Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR-Ts:+New+perspectives+in+cancer+therapy.">CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy.</a> FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).</li><li>Shokooohi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+targeted+therapy+and+immunotherapy+on+advanced+nonsmall-cell+lung+cancer+outcomes+in+the+real+world.">Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world.</a> Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).</li><li>Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+strategies+to+target+RAS+signaling+in+human+cancer+therapy.">Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 14 (1), 116 (2021).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture.">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).</li><li>Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stretchable+scaffold+with+electrochemical+sensing+for+3D+culture,+mechanical+loading,+and+real-time+monitoring+of+cells.">A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells.</a> Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+multidrug+resistance+transporter+P-glycoprotein+in+multicellular+tumor+spheroids+by+hypoxia-inducible+factor+(HIF-1)+ad+reactive+oxygen+species.">Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species.</a> FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (8), 583-592 (2006).</li><li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+How+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Br&#252;ningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumour+spheroids+for+the+prediction+of+the+effects+of+radiation+and+hyperthermia+treatments.">3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments.</a> Scientific Reports. 10, 1653 (2020).</li><li>Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+in+non-small-cell+lung+cancer.">The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer.</a> Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+The+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model.</a> Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Carragher, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns,+challenges+and+promises+of+high-content+analysis+of+3D+cellular+models.">Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models.</a> Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+morphological+and+physiological+monitoring+of+three-dimensional+tumor+spheroids+using+optical+coherence+tomography.">Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).</li><li>Yazdanfar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+robust+image-baed+autofocusing+for+digital+microscopy.">Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy.</a> Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+evaluation+of+tumor+spheroid+behavior+in+3D+culture+using+deep+learning-based+recognition.">Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition.</a> Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).</li><li>Anastasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+factors+shaping+the+cancer+metabolism+landscape.">Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape.</a> British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+clinical+significance+of+mechanical+tumor+microenvironment:+Cancer+cell+sensing,+mechanobiology+and+metastasis.">Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis.</a> Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).</li><li>Zhu, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+KRAS+cancers:+From+druggable+therapy+to+druggable+resistance.">Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).</li><li>Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+in+vitro+tumor+models+for+cell-based+immunotherapy.">Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy.</a> Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).</li><li>Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hanging-drop+multicellular+spheroids+as+a+model+of+tumor+angiogenesis.">Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis.</a> Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).</li><li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroids:+An+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis.">3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li><li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery.">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 6, 19103 (2016).</li></ol>

Mikro çevre tümör büyümesinde önemli bir rol oynar. Hücre dışı matrislerin, oksijen gradyanlarının, beslenmenin ve mekanik etkileşimin sağlanmasını etkileyebilir ve böylece gen ekspresyonunu, sinyal yollarını ve tümör hücrelerinin birçok fonksiyonunu etkileyebilir 19,20,21. Birçok durumda, 2D hücreler bu tür etkiler üretmez, hatta zıt etkiler üretir, bu nedenle ilaç tedavilerinin değerlendirilmesin...

Kanser, insanlar tarafından en çok korkulan hastalıklardan biridir, özellikle de yüksek ölüm oranı nedeniyle1. Son yıllarda, yeni tedavilerin tanıtılmasıyla kanseri tedavi etme olasılığı artmıştır 2,3,4,5. İki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) in vitro modeller, kanseri laboratuvar ortamında incelemek için kullanılır. Bununla birlikte, 2D modeller, antitümör duyarlılığını gösteren tüm önemli parametreleri hemen ve doğru bir şekilde değerlendiremez; Bu nedenle, ilaç tedavisi testinde in vivo etkileşimleri tam olarak temsil edemezler6.
2020'den bu yana, küresel üç boyutlu (3D) kültür pazarı büyük ölçüde artırıldı. NASDAQ OMX'in bir raporuna göre, 3D hücre kültürü pazarının küresel değeri 2025 yılı sonuna kadar 2,7 milyar doları aşacak. 2D kültür yöntemleri ile karşılaştırıldığında, 3D hücre kültürü, sadece çoğalma ve farklılaşma için değil, aynı zamanda uzun süreli sağkalım için de optimize edilebilen avantajlı özellikler sergiler 7,8. Bu sayede, genomik ve protein değişikliklerinin daha iyi anlaşılabilmesi için metabolik profillemenin yanı sıra daha doğru tümör karakterizasyonu elde etmek için in vivo hücresel mikro ortamlar simüle edilebilir. Bu nedenle, 3D test sistemleri artık ana akım ilaç geliştirme operasyonlarına, özellikle de yeni antitümör ilaçların taranması ve değerlendirilmesine odaklananlara dahil edilmelidir. Ölümsüzleştirilmiş yerleşik hücre hatlarının veya primer hücre kültürlerinin küresel yapılardaki üç boyutlu büyümeleri, hipoksi ve ilaç penetrasyonu gibi tümörlerin in vivo özelliklerinin yanı sıra hücre etkileşimi, yanıtı ve direncine sahiptir ve in vitro ilaç taraması 9,10,11 gerçekleştirmek için sıkı ve temsili bir model olarak kabul edilebilir.
Bununla birlikte, bu 3D kültür modelleri, çözülmesi biraz zaman alabilecek çeşitli problemlerden de muzdariptir. Hücre sferoidleri bu protokoller kullanılarak oluşturulabilir, ancak kültür zamanı veya jellerin gömülmesi12 gibi belirli ayrıntılarda farklılık gösterirler, bu nedenle bu yapılandırılmış hücre sferoidleri sınırlı bir boyut aralığında iyi kontrol edilemez. Sferoidlerin boyutu, canlılık testinin ve görüntüleme analizinin tutarlılığını etkileyebilir. Büyüme mikro ortamları ve büyüme faktörleri de değişir, bu da hücreler arasındaki farklılaşmadaki farklılıklar nedeniyle farklı morfolojilere yol açabilir13. Artık kontrollü boyutlarda her türlü tümörü oluşturmak için standart, basit ve uygun maliyetli bir yönteme ihtiyaç duyulmaktadır.
Başka bir açıdan bakıldığında, morfolojiyi, canlılığı ve büyüme hızını değerlendirmek için homojen tahliller ve yüksek içerikli görüntüleme yaklaşımları geliştirilmiş olmasına rağmen, 3D modellerin yüksek verimli taraması, tümör sferoidlerinin pozisyonunda, boyutunda ve morfolojisinde tekdüzelik eksikliği gibi literatürde bildirilen çeşitli nedenlerden dolayı bir zorluk olmaya devam etmektedir14,15,16.
Burada sunulan protokolde, 3D tümör sferoidlerinin yapımındaki her adımı listeliyoruz ve diğer avantajlı özelliklerin yanı sıra otomatik odaklama, otomatik görüntüleme ve analizi içeren yüksek verimli, yüksek içerikli bir görüntüleme sistemi kullanarak küresel gözlem ve analiz için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntemin, yüksek verimli görüntüleme için uygun olan tek tip boyutta 3D tümör sferoidlerini nasıl üretebileceğini gösteriyoruz. Bu sferoidler ayrıca kanser ilacı tedavisine karşı yüksek duyarlılık gösterir ve sferoidlerdeki morfolojik değişiklikler yüksek içerikli görüntüleme kullanılarak izlenebilir. Özetle, bu metodolojinin sağlamlığını, ilaç değerlendirme amacıyla 3D tümör yapıları üretmenin bir aracı olarak gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-10 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5&#160;mL Boil proof microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000&#956;L Pipette tips</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG1313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L Pipette tips</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>T-200-Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D gel</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>MA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well U bottom Plate</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>P02-48UWP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>&#160;DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Certified FBS</td>
			<td>BI</td>
			<td>04-001-1ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>W433884-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>sigma</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel sofware&#160;</td>
			<td>Microsoft office</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism sofware&#160;</td>
			<td>GraphPad software&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Content Microscope and SMART system</td>
			<td>Avatarget</td>
			<td>1-I01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51300-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin Sol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Fluoroskan Ascent</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 Flask</td>
			<td>JET Biofil</td>
			<td>TCF012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, 0.25% (1X)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3d tumor spheroids for drug evaluation studies

Son yıllarda, tek katmanlı kültürlü hücrelere ek olarak, üç boyutlu tümör sferoidleri, antikanser ilaçların değerlendirilmesi için potansiyel olarak güçlü bir araç olarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, geleneksel kültür yöntemleri, tümör sferoidlerini üç boyutlu düzeyde homojen bir şekilde manipüle etme yeteneğinden yoksundur. Bu sınırlamayı ele almak için, bu yazıda, ortalama büyüklükteki tümör sferoidlerini oluşturmak için uygun ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, tüm plakayı tarayabilen ve üç boyutlu sferoidler hakkında veri elde edebilen yapay zeka tabanlı analiz yazılımı kullanarak görüntü tabanlı bir analiz yöntemini açıklıyoruz. Çeşitli parametreler üzerinde çalışıldı. Standart bir tümör sferoid yapım yöntemi ve yüksek verimli bir görüntüleme ve analiz sistemi kullanılarak, üç boyutlu sferoidler üzerinde yapılan ilaç testlerinin etkinliği ve doğruluğu önemli ölçüde artırılabilir.

Şekil 1A,B, bu çalışmada tümör sferoidlerinin yapımında kullanılan süreci göstermektedir. İlk önce hücreleri 48 delikli bir U-dip plakasına tohumladık. Bu adım, 2D hücre kültüründe kullanılanla neredeyse aynıdır. Plakayı, kuyucukları çevreleyen su ile ortak bir inkübatörde tuttuk, böylece biriken hücreler kendi kendine montaj işleminde küreler oluşturmaya başladı. Normal çalışma koşulları altında, çoğu tümör sferoid tipi, hedefl...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies at JoVE.com

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

Bu makalede, üç boyutlu tümör sferoidlerinin oluşturulması için standartlaştırılmış bir yöntem gösterilmektedir. Otomatik bir görüntüleme sistemi kullanarak küresel gözlem ve görüntü tabanlı derin öğrenme analizi için bir strateji de açıklanmaktadır.

İlaç Değerlendirme Çalışmaları için 3D Tümör Sferoidlerinin Üretimi

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Bu protokol, sferoidlerin üç boyutlu tümörlerini oluşturmak için standartlaştırılmış bir yöntem gösterdi. Ve bu metodoloji, 3D tümör yapılarının yüksek devre ve yüksek içerik analizini sağladı. Standart bir tümörlü sferoid yapı yöntemi ve yüksek verimli bir görüntüleme ve analiz sistemi kullanılarak, üç boyutlu sferoidler üzerinde oluşturulan ilaç testlerinin etkinliği ve doğruluğu önemli ölçüde artırılabilir.Bu protokolde, NCI-H23 sferoidini örnek olarak tedavi etmek için AMG510'u kullandık. Deneyden, kanserli hedefli ilacın tümör sferoidleri üzerinde önemli bir etkisini gözlemleyebildik. Başlamak için, U şeklinde bir kuyu tabanına sahip 48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre yapışma önleyici reaktif pipet edin ve 10 dakika bekletin.10 dakika sonra, kaplama reaktifini aspire edin ve sterilize PBS ile iki kez yıkayın. Kültür plakasını, kullanıma kadar% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş havada 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin.Daha sonra, kültür ortamını çıkarmak için bir T25 şişesinde kültürlenmiş hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve genişlemiş hücreleri bir mililitre% 0.25 tripsin EDTA ile 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte bir inkübatörde bir ila iki dakika boyunca tedavi edin. Mikroskop altında hücre şeklini onaylayın. Daha sonra T25 şişesinde kullanılan tripsin EDTA süspansiyonunu aspire ederek ve hücreleri dört mililitre taze ortam ile yıkayarak tripsin tedavisini durdurun.Tüm süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve artık hücreleri yıkamak ve tüpe eklemek için bir mililitre taze ortam kullanın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 186.48 G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücre peletine 10 mililitre taze ortam ekleyin ve hücreler homojen bir süspansiyona girene kadar hafifçe pipet yapın.0.1 mililitre hücre süspansiyonunu yeni bir santrifüj tüpüne aspire edin. 0,9 mililitre taze ortam ekleyin ve ardından süspansiyonu iyice pipetin. Hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini çıkarın.Bu işlemi bir veya iki kez tekrarlayın ve ortalama bir değer alın. Mililitre başına 50.000 hücrelik nihai tohumlama yoğunluğuna ulaşmak için süspansiyonu seyreltin. Daha sonra, 48 kuyucuklu bir U-taban plakasının her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.Sızdırmazlık filmini plakanın etrafına sarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 119.35 G'de santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, koruyucu filmi çıkarın ve kuyucukları çevreleyen su kanalına beş ila sekiz mililitre sterilize su ekleyin. Plakayı beş gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Bu süre zarfında su kanalına herhangi bir su değiştirmeyin veya takviye etmeyin ve takip eden beş gün boyunca hücre agregasyonunu gözlemleyin. Jel gömme için, dondurulmuş jeli eksi 20 santigrat derece buzdolabından çıkardıktan sonra, deney sırasında tüm süre boyunca bir buz kutusuna yerleştirin. Hücre sferoidlerini mikroskop altında gözlemleyin.Jel gömme başlamadan önce, sferoidlerin durumu tekrar kontrol edilmelidir. Ortamın 150 mikrolitresini dikkatlice çıkarın ve önceden soğutulmuş pipet ucunu kuyunun etrafında ve içinde hareket ettirirken sıvı jeli kuyunun duvar tarafından yavaşça ekleyerek her bir sferoidi jelin içine yerleştirin. Beş dakika bekleyin ve jel eşit şekilde yayılmazsa, jeli 10 mikrolitrelik bir pipet ucuyla hafifçe pipetin.Her kuyucuk bir tümör sferoidi, mililitre jel başına 25 mikrolitre 3.5 miligram ve 50 mikrolitre tam kültür ortamı içerir. Kontrollere 75 mikrolitre ortam da ekleyin. Hidrojelasyon tamamen tamamlanana kadar plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin.Jelasyon durumunu mikroskop altında onaylayın. Her numuneye 125 mikrolitre taze ortam yerleştirin ve sferoidleri 7 ila 10 gün daha kültürleyin. Her biri dört ila altı kuyucuklu sferoid grupları hazırlayın ve analiz için bunlardan en az üçünü seçin.İlacı üreticinin talimatlarına göre çözün ve DMSO ile 100 kat çalışma çözeltisi hazırlayın. Pozitif bir kontrol olarak% 0.1 DMSO kullanın ve her bir kuyucuğa 125 mikrolitre ilaçla tedavi edilmiş ortam ekleyin. Plakayı,% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş havada 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin.Bu aşamada, her kuyucuk bir tümör sferoidi, mililitre jel başına 25 mikrolitre 3.5 miligram ve 175 mikrolitre ortam içerir. Kontroller 200 mikrolitre ortam içerir. Üreticinin yönergelerine göre bir alamarBlue tahlil kiti kullanarak küresel canlılığı ölçün.Her bir kuyucuktan 100 mikrolitre süpernatant ortamı yeni bir test plakasına aspire edin. Ardından, bir mikroplaka fotometre kullanarak canlılığı ölçün. Sferoidleri jele gömdükten sonra birinci gün, dördüncü gün, yedinci gün ve 10. günde ölçün.Kültür plakasının her bir kuyucuğuna 80 mikrolitre taze ortam ekleyin. Ardından, ilaçla tedavi edilen ortamın başka bir 100 mikrolitresini değiştirin. Kuyuda alamarBlue kalıntısı olmadığından emin olun.Görüntülemeden önce ortamın 100 mikrolitresini aspire edin ve plakayı sahneye yerleştirin. On kat hedefe sahip otomatik bir mikroskop kullanarak sferoidlerin dijital görüntülerini elde edin. Mikroskop bu küreleri otomatik olarak odaklayabilir ve merkezileştirebilir.Otomatik görüntülemeyi bekleyin. Her küre için dört görüntü elde edilir. Yüksek içerikli görüntüleme sistemine bağlı yazılım ile entegre bir görüntü oluşturulur ve işlenir.Görüntü yama işlemi düğmesine tıklayın ve yazılımdaki entegre görüntüleri seçin. U net modeli'ni seçin ve dönüşüm oranını yazın. Görüntü işlemeyi başlatmak için ekranın altına tıklayın.Çap, çevre ve pürüzlülük verilerini elektronik tablo yazılımına kaydedin. Son olarak, ilaçla birlikte 100 mikrolitre taze ortam ekleyin ve plakayı% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş havada 37 santigrat derecede inkübatöre geri yerleştirin. Farklı konsantrasyonlarda AMG510 ile muamele edilen ve yüksek içerikli bir mikroskop tarafından otomatik olarak yakalanan NCI-H23 hücre sferoidlerinin parlak alan görüntüleri bu şekilde gösterilmiştir.Sütunlar farklı günleri, satırlar ise farklı ilaç konsantrasyonlarını temsil eder. Sonuçlar, her koşul için üç sferoid içerir. AMG510 ile tedavi edilen örnek gruplarının tümör sferoid canlılığı birinci gün, dördüncü gün, yedinci gün ve 10. günde ölçüldü.Konsantrasyon gradyanlarına sahip numunelerin terminal hücre canlılığı bu şekilde gösterilmiştir. Tümör sferoid çapları birinci gün, dördüncü gün, yedinci gün ve 10. günde ölçüldü. Küresel büyüme oranı, orijinal hacme göre terminal hacmi olarak tanımlandı ve küresel çaplar kullanılarak hesaplandı.Sferoid büyüme inhibisyon oranı hacme göre tanımlandı ve sferoid çaplar kullanılarak hesaplandı. Tümör pürüzlülüğü, yazılım tarafından birinci gün, dördüncü gün, yedinci gün ve 10. günde ölçüldü ve tümör sferoidlerinin invazivliğini gösterdi. Sferoidin çevresi, derin öğrenme algoritmaları kullanılarak yazılım tarafından bulundu ve çizildi.Odak düzlemindeki küresel alanlar daha sonra J görüntüsü ile ölçüldü ve bu verilere dayanarak fazla bir çevre indeksi hesaplandı. Bu mesajın takip edilmesi kolay olsa da, örneklerin yine de dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Yüksek işlem hacmi üç boyutlu tümör pulcuklarının nesil uyuşturucu taraması

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Spheroidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tümör-Stroma Etkileşimi ve İlaç Keşfini İncelemek İçin Yeni Bir Stromal Fibroblast-Modüle 3D Tümör Küresel Modeli

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...