Name: extracting modified microtubules from mammalian cells to study microtubule-protein complexes by cryo-electron microscopy
Uploaded: 2023-03-03T13:50:00
Duration: 8 min 2 s
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Agradecemos a todos los miembros de los grupos Sixma, Brummelkamp y Perrakis por sus fructíferas discusiones científicas y por proporcionar un ambiente de trabajo agradable, y específicamente, agradecemos a Jan Sakoltchik ("persona 2") por ayudar a determinar la concentración de proteínas representada en la Figura 3C. También nos gustaría agradecer a la instalación crio-EM de NKI y al Centro Holandés de Nanoscopía Electrónica (NeCEN) en la Universidad de Leiden por su apoyo. Este trabajo fue apoyado por la subvención 016.Vici.170.033 de NWO Vici otorgada a T.R.B.. A.P. y T.R.B. son investigadores de Oncode y reciben fondos de NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. recibió fondos del Austrian Science Fund (FWF JB4448-B). Esta investigación fue apoyada por una subvención institucional de la Sociedad Holandesa del Cáncer y del Ministerio holandés de Salud, Bienestar y Deporte.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo.
1. Cultivo celular
NOTA: Todo cultivo celular debe realizarse en una campana de flujo laminar estéril.
<ol><li>Para seguir este protocolo, primero descongele un vial de células congeladas en un baño de agua a 37 °C. Aquí, utilizamos una línea celular HCT116 modificada genéticamente que carece de las tres enzimas destirosinizantes conocidas, VASH1, VASH2 y MATCAP, para crear tubulina tirosinizada.</li>
	<li>Preparar una placa de Ø 10 cm que contenga 10 ml del medio de cultivo celular apropiado. NOTA: En este protocolo, se utilizó DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) suplementado con FCS (suero fetal de ternera) al 10% v/v y antibiótico penicilina/estreptomicina (medio de cultivo) para la línea celular HCT116 modificada genéticamente.</li>
	<li>Cuente las células y siembre ~2.5 × 106 celdas viables (~20% de confluencia) en la placa preparada de 10 cm. Agite el plato suavemente para distribuir uniformemente las células. Incubar el plato en una incubadora de cultivo celular a 37 °C gaseada con 5% (v/v) deCO2 hasta que las células alcancen una confluencia del 80%-90%. NOTA: Normalmente, esto toma 3 días para las células HCT116, pero el tiempo podría depender de la densidad de siembra específica y la línea celular utilizada.</li>
	<li>Deseche el medio de cultivo celular con una pipeta o aspirador de vacío y lave el plato 2 x 5 ml de PBS. NOTA: Tenga cuidado de no dispensar el PBS con demasiada fuerza sobre la monocapa celular, ya que esto podría separar las células de la placa.</li>
	<li>Agregue 1-2 ml de tripsina e incube las células en la incubadora durante 2-5 minutos para separar las células.</li>
	<li>Agregue 2 ml del medio de cultivo a la placa para apagar la tripsina.</li>
	<li>Dividir la suspensión celular en tres a cinco partes iguales y volver a sembrarlas para expandir las células en medio de cultivo hasta obtener 6-12 placas confluentes de 15 cm.</li>
</ol>2. Cosecha
<ol><li>Lave las células suavemente con 10 ml de PBS (1x) para eliminar cualquier medio de cultivo celular.</li>
	<li>Separe las células de las placas incubándolas durante 5 min a temperatura ambiente con 3 ml de PBS helado suplementado con 5 mM EDTA (estéril/filtrado) y, posteriormente, utilizando un raspador celular.</li>
	<li>Recoja las células en un tubo de 50 ml sobre hielo y gire hacia abajo (10 min, 250 × g).<ol><li>Tenga en cuenta el volumen de las células cosechadas con la escala volumétrica en el tubo de 50 ml. NOTA: El volumen esperado puede estar entre ~0.5 ml y 4 ml. PASO DE PAUSA: Congelar rápidamente el pellet de la celda en LN2 y almacenar a -20 °C hasta su uso. Tenga en cuenta que el pellet de la célula se puede almacenar sólo durante unas pocas semanas o meses. Si el pellet se mantiene por más tiempo, entonces podría resultar en una disminución del rendimiento o en la ausencia de microtúbulos en absoluto.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Extracción de microtúbulos
NOTA: Mantenga todo para los pasos 3.1-3.5 en hielo; todo desde el paso 3.6 en adelante debe mantenerse caliente (30-37 °C).
<ol><li>Prepare 10 ml de tampón de lisis helada que contenga 100 mM PIPES/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF y una tableta inhibidora de proteasa (mini).</li>
	<li>Resuspenda el pellet de células cosechadas en un tampón de lisis 1:1 v/v (si tiene dudas sobre el volumen exacto, tome menos tampón de lisis en lugar de más).</li>
	<li>Lise las células por sonicación: 15 s encendido, 45 s apagado, amperio 30, cuatro ciclos (determine las condiciones experimentalmente y cambie de acuerdo con el sonicador).<ol><li>Después de la sonicación, recolecte una muestra para el análisis SDS-PAGE: 2 μL de lisado + 18 μL de agua + 5 μL de tampón de muestra 5x SDS. NOTA: Verifique bajo un microscopio óptico estándar si las células se han lisado completamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Pipetear las células lisadas en un tubo centrífugo. Girar durante 1 h a 100.000 × g a 4 °C en un rotor de ultracentrífuga para eliminar el lisado. NOTA: Asegúrese de que todos los bolsillos del rotor estén secos y limpios para garantizar el equilibrio correcto de la centrífuga.</li>
	<li>Use una jeringa para extraer el lisado aclarado. Tenga cuidado de no molestar el pellet, así como la capa flotante en la parte superior.<ol><li>Recoger una muestra del lisado aclarado: 2 μL de lisado + 18 μL de agua + 5 μL de 5x tampón de muestra SDS.</li>
		<li>Enjuague cuidadosamente el pellet y recoja un poco del pellet girando una punta de pipeta P10 a través del pellet; añadir 200 μL de agua y 50 μL de tampón SDS.</li>
	</ol></li>
	<li>Complementar el sobrenadante del paso anterior con 1 mM GTP y 20 μM paclitaxel para polimerizar los microtúbulos; para un volumen de 1 ml, añadir 10 μL de paclitaxel de 2 mM y 10 μL de GTP de 100 mM. PRECAUCIÓN: El paclitaxel puede causar irritación de la piel, daño ocular grave, irritación respiratoria, defectos genéticos, daño al feto y daño a los órganos. La exposición prolongada o repetida causa daño a los órganos. No respire, rocíe ni desempolve la sustancia de ninguna manera. Use guantes de nitrilo de goma para evitar el contacto con la piel.</li>
	<li>Incubar el sobrenadante suplementado con GTP/paclitaxel durante 30 min a 37 °C para permitir que los microtúbulos se ensamblen.</li>
	<li>Durante este paso de incubación, deje que el rotor y la ultracentrífuga se calienten hasta 30 °C.</li>
	<li>Prepare el tampón amortiguador: Agregue 0.6 ml de glicerol a 0.4 ml de tampón de lisis y complemente la mezcla con paclitaxel de 20 μM. Precaliente el amortiguador a 37 °C.</li>
	<li>Añadir 800 μL de tampón de amortiguación a un tubo de ultracentrífuga. Pipetear el lisado suplementado con GTP/paclitaxel cuidadosamente en la parte superior del amortiguador. NOTA: Evite la mezcla del amortiguador y el lisado pipeteando muy suavemente.</li>
	<li>Girar durante 30 minutos a 100.000 × g a 30 °C en un rotor ultracentrífugo. Marque el borde orientado hacia afuera del tubo de centrifugación para reconocer fácilmente dónde debe formarse el pellet de microtúbulos.</li>
	<li>Retire el amortiguador con cuidado con una pipeta, teniendo cuidado de no alterar el pellet de microtúbulos.<ol><li>Recoger una muestra del tampón de amortiguación: 2 μL + 18 μL de agua + 5 μL de tampón de muestra 5x SDS.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave el pellet cuidadosamente 3x con tampón de lisis caliente para eliminar el glicerol. Dispense suavemente el tampón caliente junto al pellet (sin enjuagar el líquido directamente sobre el pellet), gire el tubo varias veces para eliminar la mayor cantidad de glicerol posible del pellet y las paredes del tubo, y luego aspire y repita. NOTA: Si el glicerol no se lava correctamente, la rejilla se derretirá muy rápidamente bajo la iluminación de electrones. Esto podría evidenciarse por el alto movimiento de partículas, creando imágenes borrosas.</li>
	<li>Prepare el tampón de resuspensión con los siguientes ingredientes: 100 mM PIPES/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH y 1 mM MgCl2, y caliente el tampón a 37 °C.</li>
	<li>Resuspender suavemente el pellet lavado con una punta cortada en ~50 μL de tampón de resuspensión precalentado y mantener el tubo a 37 °C.<ol><li>Recoger una muestra de la fracción de pellet resuspendida: 2 μL + 18 μL de agua + 5 μL de 5x tampón de muestra SDS. CONSEJO: La punta cortada evita la rotura de los microtúbulos. Prepare un bloque calefactor metálico a 37 °C y guárdelo en una caja de poliestireno para que los tubos de muestra puedan transportarse fácilmente sin enfriarlos a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Preparación de la rejilla crio-EM
<ol><li>Prepare el dispositivo congelador de inmersión instalando el papel secante. Caliente el congelador de inmersión hasta 30 °C y ajuste la humidificación al 100%. Permita ~ 30 min para equilibrar la temperatura y la humedad.</li>
	<li>Prepare la configuración del congelador de inmersión en dos aplicaciones y ejecute todo el programa una vez para asegurarse de que la configuración esté configurada correctamente. Asegúrese de que la primera aplicación tenga una fuerza de 10, 2 s de tiempo de borrado y 0 s de tiempo de espera y que la segunda aplicación tenga una fuerza de 10, 6,5 s de tiempo de borrado y 10 s de tiempo de espera.</li>
	<li>Descarga incandescente las rejillas crioelectromagnéticas a 30 mA durante 60 s.</li>
	<li>Enfríe el conjunto del recipiente de poliestireno con LN2 y prepare etano líquido en una taza de metal condensando el gas etano en una taza de metal fría.</li>
	<li>Prepare un tampón de dilución con los siguientes componentes: 100 mM PIPES/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH y 1 mM MgCl2, y caliéntelo a 37 °C.</li>
	<li>Diluir la proteína que interactúa con microtúbulos 1:1 v/v con tampón de dilución justo antes de aplicarla a las rejillas para asegurar que la concentración de sal se reduzca (utilizamos una concentración final de sal de 50 mM de NaCl). Mantener la mezcla a 37 °C.</li>
	<li>Tome una rejilla descargada de brillo con pinzas de inmersión y haga clic en ellas en el congelador de inmersión.</li>
	<li>Coloque el recipiente de poliestireno con etano líquido en el congelador de inmersión y ejecute el programa preparado: primero aplique 3.5 μL de solución de microtúbulos a la rejilla, deje que el congelador de inmersión seque la rejilla, luego aplique inmediatamente 3.5 μL de proteína recién diluida y, por último, deje que el émbolo se seque y congele la rejilla en etano líquido.</li>
	<li>Transfiera las redes a una caja de almacenamiento de red y guárdelas en un dewar LN2 hasta que se cree la imagen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+code+and+its+role+in+controlling+microtubule+properties+and+functions.">The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).</li><li>Peris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor-dependent+microtubule+disassembly+driven+by+tubulin+tyrosination.">Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination.</a> Journal of Cell Biology. 185 (7), 1159-1166 (2009).</li><li>McKenney, R. J., Huynh, W., Tanenbaum, M. E., Bhabha, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cytoplasmic+dynein+motility+by+dynactin-cargo+adapter+complexes.">Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes.</a> Science. 345 (6194), 337-341 (2014).</li><li>Barisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+detyrosination+guides+chromosomes+during+mitosis.">Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis.</a> Science. 348 (6236), 799-803 (2015).</li><li>Sirajuddin, M., Rice, L. M., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microtubule+motors+by+tubulin+isotypes+and+post-translational+modifications.">Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and post-translational modifications.</a> Nature Cell Biology. 16 (4), 335-344 (2014).</li><li>Nogales, E., Kellogg, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+the+high-resolution+cryo-EM+visualization+of+microtubules+and+their+binding+partners.">Challenges and opportunities in the high-resolution cryo-EM visualization of microtubules and their binding partners.</a> Current Opinion in Structural Biology. 46, 65-70 (2017).</li><li>Manka, S. W., Moores, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+structure+by+cryo-EM:+Snapshots+of+dynamic+instability.">Microtubule structure by cryo-EM: Snapshots of dynamic instability.</a> Essays in Biochemistry. 62 (6), 737-751 (2018).</li><li>Chaaban, S., Carter, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dynein-dynactin+on+microtubules+shows+tandem+adaptor+binding.">Structure of dynein-dynactin on microtubules shows tandem adaptor binding.</a> Nature. 610 (7930), 212-216 (2022).</li><li>Lacey, S. E., He, S., Scheres, S. H., Carter, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+of+dynein+microtubule-binding+domains+shows+how+an+axonemal+dynein+distorts+the+microtubule.">Cryo-EM of dynein microtubule-binding domains shows how an axonemal dynein distorts the microtubule.</a> eLife. 8, 47145 (2019).</li><li>Walton, T., Wu, H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+microtubule-bound+axonemal+dynein.">Structure of a microtubule-bound axonemal dynein.</a> Nature Communications. 12, 477 (2021).</li><li>Sindelar, C. V., Downing, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic-level+mechanism+for+activation+of+the+kinesin+molecular+motors.">An atomic-level mechanism for activation of the kinesin molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4111-4116 (2010).</li><li>Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+origin+of+microtubule+dynamic+instability+and+its+modulation+by+EB+proteins.">Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins.</a> Cell. 162 (4), 849-859 (2015).</li><li>Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBs+Recognize+a+nucleotide-dependent+structural+cap+at+growing+microtubule+ends.">EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends.</a> Cell. 149 (2), 371-382 (2012).</li><li>Benoit, M. P. M. H., Asenjo, A. B., Sosa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+the+structural+basis+of+microtubule+depolymerization+by+kinesin-13s.">Cryo-EM reveals the structural basis of microtubule depolymerization by kinesin-13s.</a> Nature Communications. 9, 1662 (2018).</li><li>Kellogg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+model+of+microtubule-tau+interactions.">Near-atomic model of microtubule-tau interactions.</a> Science. 360 (6394), 1242-1246 (2018).</li><li>Brotzakis, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+ensemble+of+a+Tau-microtubule+complex+reveals+regulatory+Tau+phosphorylation+and+acetylation+mechanisms.">A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms.</a> ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).</li><li>Kellogg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+distinct+mechanisms+of+action+of+taxane+and+non-taxane+microtubule+stabilizers+from+cryo-EM+structures.">Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).</li><li>Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+assembly+purification+of+microtubules+without+assembly-promoting+agents+and+further+purification+of+tubulin,+microtubule-associated+proteins,+and+MAP+fragments.">Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments.</a> Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).</li><li>Wloga, D., Joachimiak, E., Louka, P., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+tubulin+and+cilia.">Posttranslational modifications of tubulin and cilia.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), 028159 (2017).</li><li>Nieuwenhuis, J., Brummelkamp, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tubulin+detyrosination+cycle:+Function+and+enzymes.">The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes.</a> Trends in Cell Biology. 29 (1), 80-92 (2019).</li><li>Nieuwenhuis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasohibins+encode+tubulin+detyrosinating+activity.">Vasohibins encode tubulin detyrosinating activity.</a> Science. 358 (6369), 1453-1456 (2017).</li><li>Aillaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasohibins/SVBP+are+tubulin+carboxypeptidases+(TCPs)+that+regulate+neuron+differentiation.">Vasohibins/SVBP are tubulin carboxypeptidases (TCPs) that regulate neuron differentiation.</a> Science. 358 (6369), 1448-1453 (2017).</li><li>Landskron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+microtubules+by+the+MATCAP+detyrosinase.">Posttranslational modification of microtubules by the MATCAP detyrosinase.</a> Science. 376 (6595), (2022).</li><li>Erck, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vital+role+of+tubulin-tyrosine-ligase+for+neuronal+organization.">A vital role of tubulin-tyrosine-ligase for neuronal organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7853-7858 (2005).</li><li>Pagnamenta, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+tubulin+detyrosination+causes+structural+brain+abnormalities+with+cognitive+deficiency+in+humans+and+mice.">Defective tubulin detyrosination causes structural brain abnormalities with cognitive deficiency in humans and mice.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3391-3405 (2019).</li><li>Peris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+tyrosination+regulates+synaptic+function+and+is+disrupted+in+Alzheimer's+disease.">Tubulin tyrosination regulates synaptic function and is disrupted in Alzheimer's disease.</a> Brain. 145 (7), 2486-2506 (2022).</li><li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles.">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nature Protocols. 14 (5), 1634-1660 (2019).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tubulin+from+porcine+brain.">Purification of tubulin from porcine brain.</a> Methods in Molecular Biology. 777, 15-28 (2011).</li><li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tubulin+with+controlled+posttranslational+modifications+and+isotypes+from+limited+sources+by+polymerization-depolymerization+cycles.">Purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61826 (2020).</li><li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer.">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).</li><li>Li, G., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+at+low+temperature:+evidence+that+tubulin+recycling+limits+assembly.">Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).</li><li>Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+cryo-EM+structure+of+PRC1+bound+to+the+microtubule.">Near-atomic cryo-EM structure of PRC1 bound to the microtubule.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9430-9439 (2016).</li><li>Maurer, S. P., Bieling, P., Cope, J., Hoenger, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP&#947;S+microtubules+mimic+the+growing+microtubule+end+structure+recognized+by+end-binding+proteins+(EBs).">GTP&#947;S microtubules mimic the growing microtubule end structure recognized by end-binding proteins (EBs).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (10), 3988-3993 (2011).</li><li>Manka, S. W., Moores, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudo-repeats+in+doublecortin+make+distinct+mechanistic+contributions+to+microtubule+regulation.">Pseudo-repeats in doublecortin make distinct mechanistic contributions to microtubule regulation.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51534 (2020).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este método describe cómo extraer rápidamente la tubulina endógena de las líneas celulares y posteriormente decorar esos microtúbulos en rejillas crio-EM. Los microtúbulos son sensibles a la temperatura. Se despolimerizan en un ambiente frío y polimerizan en un ambiente cálido31. Por lo tanto, es crítico ejecutar el espín de sonicación y aclaramiento (pasos 1.1-1.5) a 4 °C para solubilizar la tubulina. Si algún factor estabilizara los microtúbulos tan bien que no se despolimerizaran en este paso, estos microtúbulos y los factores estabilizadores se descartarían en el pellet después del giro inicial de aclaramiento. Después de (re)polimerizar los microtúbulos, es importante mantener caliente en todo momento la solución que contiene los microtúbulos polimerizados. Se extrajeron los microtúbulos de las células HCT116, que son deficientes en las proteínas VASH1, VASH2 y MATCAP. Otras líneas celulares, así como tejidos, se pueden utilizar para extraer microtúbulos29, aunque los contaminantes, los isotipos de tubulina y el rendimiento podrían ser muy diferentes de lo que se describe aquí. La sobreexpresión de plásmidos que contienen enzimas modificadoras también se puede utilizar para introducir modificaciones específicas de la tubulina.
Otros protocolos 18,27,28,29,30 utilizan múltiples ciclos de polimerización y despolimerización de los microtúbulos para obtener microtúbulos vacíos de otras proteínas que interactúan. Aquí, hemos simplificado estos protocolos y solo polimerizamos los microtúbulos una vez. Es posible que debido a esta polimerización única, estos microtúbulos puedan co-sedimentar con otras proteínas que interactúan con microtúbulos. Sin embargo, hemos encontrado que este protocolo proporciona microtúbulos suficientemente puros para fines crio-EM. Si se necesita una muestra más pura para ensayos específicos, ciclos adicionales de polimerización y despolimerización podrían producir una muestra más pura, aunque esto podría ser a expensas del rendimiento de microtúbulos. En este protocolo, utilizamos paclitaxel para polimerizar los microtúbulos. Sin embargo, paclitaxel podría sesgar la red de microtúbulos hacia un cierto giro y aumento, lo que podría interferir con la afinidad de los microtúbulos de la proteína de interés. Se podrían utilizar otros reactivos estabilizadores de microtúbulos si el paclitaxel no es adecuado; ejemplos de estos reactivos son moléculas no taxanas como peloruside o variantes GTP no hidrolizables como GMPCPP17,32.
Para investigar estructuralmente las proteínas que se unen a los microtúbulos en las rejillas crio-EM, es necesario unir una cantidad suficiente de la proteína de interés a los microtúbulos. Un problema común es que los complejos de proteínas que son estables en solución se desmoronan en la red. Para formar el complejo de proteínas en la rejilla, era crucial colocar primero los microtúbulos en capas y luego aplicar la proteína de unión a microtúbulos con una baja concentración de sal a la rejilla recubierta de microtúbulos, ensamblando así el complejo de proteínas directamente en la rejilla. Otros han informado de manera similar un protocolo33,34 bajo en sal y un protocolo de aplicación de dos pasos34,35,36 para una decoración exitosa de microtúbulos. Es probable que una menor concentración de sal sesgue el complejo proteico hacia una interacción más estable debido a la disminución de las cargas electrostáticas. Sin embargo, debido a la baja concentración de sal, la proteína de interés está en riesgo de precipitación. Por lo tanto, es muy recomendable mantener la proteína en o alrededor de concentraciones de sal fisiológicamente relevantes hasta poco antes de vitrificar las rejillas. Este protocolo de aplicación de dos pasos probablemente evita que el complejo de proteínas se deshaga durante los pasos de secado o congelación por inmersión. En este protocolo, utilizamos el Vitrobot. Sin embargo, los métodos de vitrificación más rápidos (VitroJet) o el uso de rejillas sin manchas (Puffalot) o dispositivos que tienen ambas propiedades (camaleón) podrían superar la aplicación de dos pasos, pero actualmente no están ampliamente disponibles para pruebas.
La resolución final de la densidad crio-EM reconstruida puede verse afectada por una serie de factores, incluido el movimiento de la proteína de unión a microtúbulos en relación con el microtúbulo y el nivel de decoración que se puede lograr. Una mayor decoración de microtúbulos es probablemente beneficiosa para la resolución final obtenida en la reconstrucción de densidad 3D. Esto puede estar limitado por unos pocos factores, como la concentración más alta de proteína que se obtiene durante la purificación de la proteína de unión a microtúbulos, la concentración de sal más baja que la proteína que interactúa con microtúbulos puede soportar sin agregar y el modo de unión de la proteína que interactúa con microtúbulos (por ejemplo, la proteína podría abarcar más de un dímero de tubulina, lo que dificulta una relación de unión de 1: 1). Aunque la resolución de la reconstrucción crio-EM podría verse comprometida por microtúbulos escasamente decorados, el análisis computacional puede eludir muchos problemas, como lo ejemplifica una estructura compleja microtúbulo-proteína recientemente reportada que estaba extremadamente escasamente decorada8.
El protocolo que describimos aquí presenta un método rápido y de bajo costo para obtener microtúbulos adecuados para fines crioelectromagnéticos. En contraste con la tubulina cerebral porcina disponible comercialmente, los microtúbulos derivados de las células HCT116 deficientes en MATCAP y deficientes en vasohibina están completamente tirosinadas (Figura 4). La tubulina comercial HeLa, un reactivo caro, en principio, está relativamente uniformemente tirosinizada y contiene pocas otras modificaciones4 como la glutamilación, pero los lotes pueden variar, y la modificación solo podría lograrse in vitro. Una ventaja de extraer microtúbulos de líneas celulares hechas a medida es la flexibilidad que se tiene para sobreexpresar o eliminar enzimas modificadoras de tubulina, como las detirosinasas de tubulina, para crear un conjunto más homogéneo de microtúbulos. Esto puede beneficiar la decoración y la uniformidad de la muestra crio-EM y, en última instancia, beneficiará la facilidad y la calidad de los mapas de densidad crio-EM y las estructuras moleculares derivadas de esta muestra.

Los microtúbulos son una parte crucial del citoesqueleto; Están involucrados en diferentes funciones, como la migración y división celular, pero también contribuyen a la organización intracelular. Para adaptarse a diferentes destinos funcionales, los microtúbulos interactúan con una variedad de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP), enzimas y otras proteínas, a las que nos referiremos colectivamente como "proteínas que interactúan con microtúbulos". La unión a microtúbulos de estas proteínas puede ser guiada por diferentes modificaciones de la tubulina, comúnmente conocidas como el "código de la tubulina"1. Ejemplos de esta preferencia son la quinesina mitótica asociada al centrómero (MCAK)2 y el dominio dineína-dinactina CAP-Gly de p1503, que se asocian preferentemente con la tubulina tirosinada, mientras que los motores de quinesina asociadas a la proteína E asociada al centrómero (CENP-E)4 y la quinesina-25 prefieren la tubulina que carece de la tirosina C-terminal.
Si bien se puede emplear una variedad de métodos para estudiar las interacciones microtúbulos-proteínas, la criomicroscopía electrónica (crio-EM) se usa a menudo para estudiar estas interacciones a una resolución casi atómica 6,7. En los últimos años, las estructuras crio-EM han revelado cómo proteínas motoras grandes como la dineína 8,9,10 y la quinesina 11, proteínas +TIP como EB312,13 y MCAK14, otras proteínas como Tau15,16, e incluso moléculas pequeñas como paclitaxel, peloruside y zampanolide 17 interactuar con los microtúbulos. Para estudiar las interacciones microtúbulos-proteína, los microtúbulos se extraen típicamente del cerebro porcino18. Después de esto, la mayoría de los estudios in vitro, incluidas las estructuras de microtúbulos crio-EM, se llevan a cabo utilizando tubulina cerebral porcina. Los resultados de estos estudios, por lo tanto, oscurecen la importancia de la naturaleza heterogénea de las modificaciones de la tubulina19 entre tejidos y tipos celulares. Esto crea un problema particular cuando se investiga una proteína que requiere o prefiere una modificación específica para unirse a los microtúbulos. Esto se puede ilustrar con tubulina tirosinada, el sustrato de la microtúbulo detirosinasa MATCAP.
La destirosinación es una modificación de la tubulina en la que falta el aminoácido tirosina C-terminal de la α-tubulina, lo que se asocia con la función mitótica, cardíaca y neuronal20. Si bien los microtúbulos completamente tirosinizados son el sustrato ideal para MATCAP, esto está ausente en gran medida en los microtúbulos disponibles comercialmente del cerebro porcino debido a la función de las vasohibinas 21,22 y MATCAP 23 detirosinasas en este tejido 22,23,24,25,26. Aunque la tubulina HeLa disponible comercialmente contiene principalmente microtúbulos tirosinados, podría ocurrir la destirosinación, y esta fuente de tubulina es, por lo tanto, menos adecuada para crear una muestra uniforme para el análisis crio-EM.
Para estimular la unión de MATCAP a los microtúbulos y crear una muestra homogénea para el análisis estructural, se buscó una fuente de microtúbulos que estuviera completamente tirosinizada. Para ello, se creó una línea celular deficiente en MATCAP y vasohibina, que se utilizó para extraer microtúbulos totalmente tirosinados. El procedimiento de extracción se basó en protocolos bien establecidos que utilizan ciclos repetidos de polimerización y despolimerización de los microtúbulos para extraer tubulina del tejido o células cerebrales 18,27,28,29,30, con un solo paso de polimerización y centrifugación sobre un cojín de glicerol. Usando MATCAP como ejemplo, demostramos cómo estos microtúbulos se pueden usar para estudios crio-EM. Para preparar rejillas crio-EM, se describe un protocolo de aplicación de dos pasos a una baja concentración de sal. Los métodos en este documento describen la extracción de microtúbulos personalizables en cantidades y pureza suficientes para realizar análisis crio-EM y proporcionan un protocolo detallado sobre cómo usar estos microtúbulos para crear complejos proteína-microtúbulos en rejillas crio-EM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm plate</td>
			<td>Thermo FisherScientific</td>
			<td>168381</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547255</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools</td>
			<td>N1-C14nCu30-01</td>
			<td>Cryo-EM grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108418</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3899</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Serana</td>
			<td>s-FBS-EU-015</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24.397.296</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G8877-1G</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells</td>
			<td>self made</td>
			<td>Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05033</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105833</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubule binding protein</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>300600</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-212517</td>
			<td>caution toxic, microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin and streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0781-100mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P8203</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF (in EtOH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>16837091001</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS sample buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>Quality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD plastipak</td>
			<td>309658</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra protease tables mini</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0975224</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>47000-100</td>
			<td>Cryo-EM grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GloQube</td>
			<td>Quorum</td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid storage box</td>
			<td>SWISSCI</td>
			<td>41018</td>
			<td>Cryo-EM grid storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block, electric or metal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to warm the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator, cell culture</td>
			<td>NUAIR</td>
			<td></td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN2 dewar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cryo-EM grid storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunge-tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0508-L5-PS</td>
			<td>Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene box&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to keep the buffers warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q700</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX 41</td>
			<td>Quality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA 100.3 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes for TLA 100.3 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326819</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes for TLA 120.2 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>347356</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima MAX-XP</td>
			<td>Microtubule extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot</td>
			<td>FEI, ThermoFischer Scientific</td>
			<td>mark IV</td>
			<td>Cryo-EM grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>200703</td>
			<td>Cryo-EM grid preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracting modified microtubules from mammalian cells to study microtubule-protein complexes by cryo-electron microscopy

Los microtúbulos son una parte importante del citoesqueleto y están involucrados en la organización intracelular, la división celular y la migración. Dependiendo de las modificaciones postraduccionales, los microtúbulos pueden formar complejos con varias proteínas que interactúan. Estos complejos microtúbulos-proteínas a menudo están implicados en enfermedades humanas. La comprensión de la estructura de tales complejos es útil para dilucidar sus mecanismos de acción y puede estudiarse mediante microscopía crioelectrónica (crio-EM). Para obtener tales complejos para estudios estructurales, es importante extraer microtúbulos que contengan o carezcan de modificaciones postraduccionales específicas. Aquí, describimos un protocolo simplificado para extraer tubulina endógena de células de mamíferos modificadas genéticamente, que implica la polimerización de microtúbulos, seguida de sedimentación mediante ultracentrifugación. La tubulina extraída se puede utilizar para preparar rejillas de microscopio crioelectrónico con microtúbulos que están unidos a una proteína purificada de unión a microtúbulos de interés. Como ejemplo, demostramos la extracción de microtúbulos completamente tirosinados de líneas celulares diseñadas para carecer de las tres enzimas tubulinas destirosinizantes conocidas. Estos microtúbulos se utilizan para formar un complejo proteico con tubulina destirosinasa asociada a microtúbulos enzimáticamente inactivos en rejillas crio-EM.

Se investigó la tubulina detirosinasa MATCAP unida a microtúbulos tirosinados por crio-EM. Para ello, extrajimos microtúbulos completamente tirosinados de una línea celular HCT116 modificada genéticamente que carecía de las tres enzimas destirosinizantes conocidas, VASH1/2 y MATCAP. Utilizamos 6-12 platos confluentes de 15 cm para extraer los microtúbulos de aproximadamente 0,5-4 mL de pellet celular (Figura 1). Después de la segunda etapa de centrifugación (paso 3.11), esto produce un pellet visible pero pequeño y transparente (Figura 1I). El rendimiento de microtúbulos es típicamente ~ 75 μg. Si el pellet no es visible, esto podría indicar un problema en uno de los pasos anteriores, como una temperatura incorrecta de polimerización de microtúbulos, problemas con la calidad del GTP o paclitaxel utilizado, o la adición de demasiado tampón de lisis, lo que resulta en una concentración de tubulina que es demasiado baja para la polimerización. Para evaluar la calidad y concentración de los microtúbulos extraídos, analizamos muestras en un gel SDS teñido con Coomassie (Figura 2A). Estos análisis indicaron que los microtúbulos extraídos eran relativamente puros. La concentración interpolada de microtúbulos derivada de la cuantificación de BSA fue ~1,4 mg/ml. Esto concuerda bien con el número medido con un espectrofotómetro (Figura 2B, C).
Los microtúbulos recién extraídos se pueden utilizar directamente para hacer muestras para crio-EM. Los microtúbulos deben verse intactos y abundantes en las micrografías. Para un análisis crio-EM adicional, es clave tener una densidad de microtúbulos baja por micrografía para evitar que los microtúbulos se crucen entre sí (Figura 3A). Los microtúbulos rotos o aquellos que no son visibles pueden indicar que los microtúbulos se despolimerizaron (por ejemplo, debido a una baja temperatura o hidrólisis GTP) o que los parámetros de transferencia y congelación por inmersión no se ajustaron correctamente. El fondo alrededor de los microtúbulos es denso, presumiblemente con tubulina no polimerizada.
El peso molecular de MATCAP es de 53 kDa, y tiene un dominio catalítico globular justo por debajo del tamaño de un monómero de tubulina. Por lo tanto, la decoración de MATCAP en el microtúbulo podría detectarse visualmente. Los microtúbulos que no se unieron a MATCAP mostraron bordes "lisos", mientras que los microtúbulos que se unieron a MATCAP tenían bordes "ásperos", caracterizados por puntos densos en electrones en la superficie de los microtúbulos (Figura 3B). Los microtúbulos unidos a MATCAP y no unidos a MATCAP también podrían distinguirse en las clases 2D calculadas, aunque debido a la forma y el tamaño, esto podría diferir para otras proteínas que interactúan con microtúbulos (Figura 3C). Para confirmar que la densidad pertenece efectivamente a la proteína de interés, se puede aprovechar las estructuras determinadas o predichas experimentalmente. También sugerimos hacer una cuadrícula de control que contenga microtúbulos solo para comparar. Esto indica si los microtúbulos se polimerizaron y extrajeron intactos a una concentración suficientemente alta y que el proceso de congelación por inmersión se ejecutó correctamente. Notamos que la abundancia de microtúbulos disminuyó en las rejillas con una segunda aplicación de MATCAP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig01.jpg"> Figura 1: Guía visual de los pasos experimentales. (A) Pellet celular antes de la lisis; (B) células sonicadas en un tubo de ultracentrífuga antes de la centrifugación; (C) células sonicadas en un tubo de ultracentrífuga después de la centrifugación; (D) jeringa con el sobrenadante aclarado; E) pellets residuales después de la eliminación del sobrenadante, incluida una "capa flotante blanca"; F) Punta P10 con un pellet de restos celulares para el gel SDS Coomassie; G) sobrenadante suplementado con GTP/paclitaxel antes de la incubación; (H) sobrenadante incubado con GTP/paclitaxel sobre un cojín de glicerol en un tubo de ultracentrífuga; I) limpiar el pellet de microtúbulos después de la segunda etapa de centrifugación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig02.jpg"> Figura 2: Determinación de la pureza y concentración de los microtúbulos . (A) Gel de página SDS teñido con Coomassie que muestra las muestras tomadas durante el protocolo de extracción y una comparación de concentración de BSA. S1 y P1 corresponden al sobrenadante y al pellet después de la primera etapa de centrifugación, respectivamente. S2 y P2 corresponden de manera similar a la segunda etapa de centrifugación. (B) Una línea de regresión no lineal de las cantidades relativas de BSA derivadas de A. La interpolación de la banda de microtúbulos alrededor de 50 kDa en el carril P2 (microtúbulos) indica una concentración final de 1,42 mg/ml. (C) El análisis espectrofotométrico de los microtúbulos resuspendidos (P2) medidos por dos personas y corregidos para el coeficiente de extinción combinado de TUBA1A y TUBB3 (0,971) indica una concentración media y desviación estándar de 1,46 mg/ml ± 0,14 mg/ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig03.jpg"> Figura 3: Ejemplos de micrografías. (A) Ejemplos de micrografías que muestran microtúbulos unidos a MATCAP. Los microtúbulos indicados por una caja verde están intactos, decorados y se pueden utilizar para el análisis crio-EM. El microtúbulo indicado por la caja naranja es un microtúbulo intacto y decorado, pero se coloca cerca de los microtúbulos que quedan de él; por lo tanto, es menos adecuado incluirlo en el análisis crio-EM. Los microtúbulos en la caja roja se cruzan y se rompen. Estos deben excluirse del análisis crio-EM. (B) Una vista ampliada del microtúbulo rodeado de verde del panel izquierdo. Las puntas de flecha rojas indican los puntos negros que solo aparecieron en los microtúbulos en las micrografías que tenían una aplicación de MATCAP y, por lo tanto, probablemente corresponden a MATCAP unido al microtúbulo. (C) Ejemplo de clases 2D de partículas de microtúbulos seleccionadas de A que mostraron una decoración alta y baja y una clase 2D de un conjunto de datos diferente para el cual no observamos ninguna decoración por MATCAP (panel más a la derecha). Barras de escala = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65126/65126fig04.jpg"> Figura 4: Análisis de inmunoblot de microtúbulos derivados de células HCT116 deficientes en MATCAP y VASH1/2 deficientes en triple knockout (TKO), cerebro porcino comercial y tubulina HeLa. Abreviaturas: TKO = triple nocaut; mAb = anticuerpo monoclonal; pAb = anticuerpo policlonal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65126/65126fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Aquí, describimos un protocolo para extraer tubulina endógena de células de mamíferos, que pueden carecer o contener enzimas modificadoras de microtúbulos específicas, para obtener microtúbulos enriquecidos para una modificación específica. Luego describimos cómo los microtúbulos extraídos se pueden decorar con proteínas purificadas de unión a microtúbulos para preparar rejillas para la microscopía crioelectrónica.

Extracción de microtúbulos modificados de células de mamíferos para estudiar complejos microtúbulos-proteínas mediante microscopía crioelectrónica

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Los estudios estructurales de proteínas que interactúan con microtúbulos mediante microscopía crioelectrónica son cruciales para comprender los mecanismos celulares. La preparación de microtúbulos homogéneos unidos a proteínas que interactúan en una rejilla crio-EM es crucial para el éxito. Este protocolo es simple, barato y permite preparar microtúbulos con modificaciones post-traduccionales controladas en cantidad y calidad suficientes para la microscopía crioelectrónica.Los microtúbulos son muy sensibles a la temperatura. Por lo tanto, es importante mantener calientes las soluciones que contienen microtúbulos para evitar la despolimerización. Para comenzar, cultivo de línea celular HCT116 modificada genéticamente en medio de cultivo celular DMEM hasta obtener de seis a 12 placas confluentes.Lave las células suavemente con 10 mililitros de PBS para eliminar cualquier medio de cultivo celular. Separe las células de las placas incubando las células durante cinco minutos a temperatura ambiente con tres mililitros de PBS helado complementado con EDTA de cinco milimolares y, posteriormente, utilizando un raspador celular. Recoja las células en un tubo de 50 mililitros sobre hielo y gire a 250 G durante 10 minutos.Tenga en cuenta el volumen de las células cosechadas con la escala volumétrica en el tubo. Resuspender el pellet de células cosechadas en un volumen igual de tampón de lisis y células de lisis por sonicación. Después de la sonicación, para el análisis SDS-PAGE, agregue dos microlitros de lisado en un tubo que contenga 18 microlitros de agua y cinco microlitros de tampón de muestra 5X SDS.Pipetear las células lisadas restantes en un tubo de centrífuga y girar a 100.000 G durante una hora a cuatro grados centígrados en un rotor de ultracentrífuga para eliminar el lisado. Con una jeringa, retire el lisado aclarado sin alterar el pellet y la capa flotante en la parte superior. Agregue dos microlitros de lisado aclarado en un tubo que contenga 18 microlitros de agua y cinco microlitros de tampón de muestra 5X SDS.Enjuague cuidadosamente el pellet y recoja un poco del pellet girando una punta de pipeta P-10 a través del pellet. Luego, agregue 200 microlitros de agua y 50 microlitros de tampón SDS. Agregue un GTP milimolar y 20 micromolares de paclitaxel en un sobrenadante recolectado para polimerizar los microtúbulos e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos para permitir que los microtúbulos se ensamblen.Prepare el amortiguador de amortiguación agregando 600 microlitros de glicerol a 400 microlitros de tampón de lisis y complemente la mezcla con 20 micromolares de paclitaxel. Precaliente el amortiguador a 37 grados centígrados. Agregue 800 microlitros de amortiguador de amortiguación a un tubo de ultracentrífuga.A continuación, pipetear el lisado suplementado con GTP-paclitaxel con cuidado sobre el tampón del cojín. Coloque el tubo en un rotor ultracentrífugo para girar a 100, 000 G a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Marque el borde exterior del tubo para reconocer fácilmente dónde debe formarse el pellet de microtúbulos.Después de la centrifugación, retire el amortiguador con cuidado con una pipeta sin alterar el pellet. Agregue cuidadosamente el tampón de lisis junto al pellet, gire el tubo varias veces para eliminar la mayor cantidad de glicerol posible del pellet y las paredes del tubo, y luego aspire y repita el paso de lavado tres veces. Resuspender suavemente el pellet lavado con una punta cortada en tampón de resuspensión precalentado de 50 microlitros y colocar el tubo a 37 grados centígrados.Agregue dos microlitros de fracción de pellet resuspendida en 18 microlitros de agua y cinco microlitros de tampón de muestra 5X SDS. Prepare el dispositivo congelador de inmersión instalando el papel secante. Ajuste la temperatura del dispositivo a 30 grados centígrados y la humidificación al 100%Permita que el dispositivo se equilibre durante 30 minutos.Prepare los ajustes del congelador de inmersión para dos aplicaciones. Para la primera aplicación, establezca la fuerza en 10, dos segundos de tiempo de borrado y cero segundos de tiempo de espera. Para la segunda aplicación, establezca la fuerza en 10, 6,5 segundos de tiempo de borrado y 10 segundos de tiempo de espera.Coloque las rejillas con su lado de carbono hacia arriba en el vehículo descargador de metal incandescente. La descarga incandescente de la microscopía crioelectrónica, o rejillas EM, a 30 miliamperios durante 60 segundos. Enfríe el conjunto del recipiente de poliestireno con nitrógeno líquido y prepare etano líquido en una taza de metal condensando el gas etano en una taza de metal fría.Diluir la proteína que interactúa con los microtúbulos en igual volumen con tampón de dilución antes de aplicarla a las rejillas para reducir la concentración celular. Coloque la batidora a 37 grados centígrados. Use un bloque de metal caliente en una caja de poliestireno aislante si no hay un bloque de calentamiento cerca del dispositivo de congelación por inmersión.Tome una rejilla descargada de brillo con pinzas de inmersión y haga clic en el congelador de inmersión. Coloque el recipiente de poliestireno con etano líquido en el congelador de inmersión y ejecute el programa preparado. Primero, aplique 3.5 microlitros de solución de microtúbulos a la rejilla.Deje que el congelador de inmersión borre la rejilla. Luego, aplique inmediatamente 3.5 microlitros de proteína diluida. Y, por último, deje que el émbolo se seque y la inmersión congele la rejilla en etano líquido.Transfiera las rejillas a una caja de almacenamiento de red y guárdelas en un Dewar de nitrógeno líquido hasta que se obtengan imágenes. La calidad y la concentración de los microtúbulos extraídos se evaluaron mediante gel SDS teñido con Coomassie. Una línea de regresión no lineal de las cantidades relativas de BSA, derivada de la interpolación de la banda de microtúbulos alrededor de 50 kilodalton en el carril P2 con la curva BSA, indica una concentración final de 1,42 miligramos por mililitro.Esto concuerda bien con el número medido con un espectrofotómetro por dos personas. Los microtúbulos recién extraídos se utilizaron para hacer muestras crio-EM. Los microtúbulos se ven intactos y abundantes en las micrografías.La densidad de microtúbulos por micrografía no debe ser demasiado alta para evitar que los microtúbulos se crucen entre sí. Los microtúbulos rotos indican que los microtúbulos están despolimerizados, o que la concentración de microtúbulos era demasiado densa. Los microtúbulos unidos a MATCAP tenían bordes ásperos caracterizados por puntos densos en electrones en la superficie de los microtúbulos.Los microtúbulos no unidos a MATCAP y no unidos a MATCAP también podrían distinguirse en las clases 2D calculadas. Hacer rejillas crio-EM con este método puede permitir estudiar la estructura de los microtúbulos unidos a una proteína específica que interactúa. Esto puede conducir a una mejor comprensión de los mecanismos en la biología celular estructural.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Investigación

Bioquímica

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Preparación rápida de la rejilla para la crio-microscopía electrónica resuelta en el tiempo

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Microscopía crioelectrónica de partícula única: de la muestra a la estructura

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparación de partículas de núcleo de nucleosomas complejadas con factores de reparación de ADN para la determinación estructural de la criomicroscopía electrónica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...