Name: neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay
Uploaded: 2023-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay at JoVE.com

Ce projet a été soutenu par le Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), le Fonds d’innovation pour les sciences médicales de l’Académie chinoise des sciences médicales (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), le Fonds spécial de recherche pour les universités centrales, le Peking Union Medical College (3332022062) et le Programme de soutien scientifique et technologique de la province du Sichuan (NO. 2021YJ0480).

Le comité de soin et d’utilisation des animaux du Boston Children’s Hospital et du State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) a approuvé et surveillé toutes les procédures. La figure 1 illustre un organigramme de la culture des neutrophiles avec CLON-G et le test de mort in vitro .
1. Prolongation de la durée de vie des neutrophiles avec CLON-G
NOTE: Toutes les opérations et le matériel me...

Les neutrophiles jouent un rôle essentiel dans l’immunité innée et adaptative, et leur homéostasie est étroitement réglementée. Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique humain, et ils ont un renouvellement robuste et rapide. Un adulte en bonne santé peut libérer 1 x 109 neutrophiles / kg par jour de la moelle osseuse28. La mort des neutrophiles est donc devenue l’une des énigmes déroutantes de ce domaine, et beaucoup d’efforts ...

Les neutrophiles sont connus pour comprendre un arsenal de granules cytoplasmiques abondants, de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase, d’enzymes antimicrobiennes et de divers organites qui se défendent contre les microbes envahisseurs; De plus, ils sont très mobiles et sont les premières cellules recrutées sur le site de l’inflammation, ce qui signifie que les neutrophiles sont la première ligne de défense du système immunitaire inné 1,2. La thérapie transfusionnelle de granulocytes est donc devenue un traitement clinique prometteur pour les infections liées à la neutropénie afin de renforcer transitoirement l’immunité des neutrophiles 3,4,5. Des découvertes récentes ont clairement montré que les neutrophiles fonctionnent également comme effecteurs multifaces dans de nombreux scénarios physiopathologiques6. La durée de vie moyenne d’un neutrophile est inférieure à 24 heures et, par conséquent, la recherche fondamentale sur les neutrophiles et l’application d’études sur les neutrophiles sont extrêmement difficiles en raison des limites liées à la manipulation génétique stable et au stockage à long terme 7,8,9,10,11 . Certaines lignées cellulaires peuvent présenter partiellement certaines fonctions neutrophiles, telles que HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 et les cellules souches pluripotentes induites12. Ces lignées cellulaires peuvent réaliser une édition et une cryoconservation efficaces des gènes; Cependant, ils diffèrent encore énormément des neutrophiles primaires et, par conséquent, ne peuvent pas récapituler fidèlement les fonctions des neutrophiles13. Ainsi, la plupart des recherches dans ce domaine reposent encore sur des neutrophiles primaires fraîchement isolés. Le domaine repose toujours sur la génération de souris knock-out conditionnelles coûteuses et chronophages pour étudier des fonctions génétiques spécifiques dans les neutrophiles, mais aucun modèle humain n’existe actuellement.
Après avoir déployé nos efforts pour explorer les processus hétérogènes impliqués dans la mort des neutrophiles et les multiples voies qui régulent ces processus14,15, un nouveau traitement appelé CLON-G (caspases-perméabilisation de la membrane lysosomale-oxydant-inhibition de la nécroptose plus facteur de stimulation des colonies de granulocytes) a récemment été rapporté 16. CLON-G se compose de Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-méthylaspartyl-[-2,6-difluorophénoxy]-méthylcétone), Hsp70 (protéine de choc thermique 70), DFO (déféroxamine), NAC (N-acétylcystéine), Nec-1s (nécrostatine-1s) et G-CSF (facteur de stimulation des colonies de granulocytes). La mort spontanée des neutrophiles est médiée par de multiples voies, y compris l’apoptose, la nécroptose et la pyroptose. La Q-VD-oph inhibe l’apoptose des neutrophiles en tant qu’inhibiteur de pan-caspase en ciblant la caspase 1, la caspase 3, la caspase 8 et la caspase 917. La nécroptose neutrophile dépend d’une voie de signalisation impliquant la protéine kinase-1 interagissant avec les récepteurs (RIPK1) et la protéine mixte de type domaine kinase de lignée (MLKL)18. En tant qu’inhibiteur de RIPK1, les Nec-1 inhibent la nécroptose des neutrophiles. Hsp70 et DFO peuvent inhiber la perméabilisation de la membrane lysosomale (LMP), ce qui pourrait induire l’apoptose des neutrophiles19 et la pyroptose20. Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle vital dans la mort des neutrophiles en médiant LMP19 et apoptose21 et en inhibant les signaux de survie22. En tant qu’antioxydant pouvant réduire l’accumulation de ROS, la NAC retarde la mort des neutrophiles. En tant que facteur de croissance, le G-CSF active les signaux de survie des neutrophiles et inhibe l’apoptose induite par la calpaïne23,24. En ciblant simultanément plusieurs voies de mort spontanée des neutrophiles, la durée de vie des neutrophiles peut être prolongée efficacement à plus de 5 jours sans compromettre leur fonction. Le traitement par CLON-G élargit les possibilités de préservation, de transport et de manipulation génétique des neutrophiles, ce qui peut accélérer la recherche dans la communauté des neutrophiles. Pendant ce temps, sur la base de la connaissance de la mort des neutrophiles, les protocoles actuellement approuvés pour les tests de mort cellulaire peuvent causer des dommages inattendus aux neutrophiles14, de sorte que ces protocoles ont été affinés pour être plus appropriés pour les études sur les neutrophiles. Ce rapport fournit des protocoles détaillés pour la culture des neutrophiles avec CLON-G et un test in vitro de mort cellulaire des neutrophiles de souris utilisant la cytométrie en flux et l’imagerie par fluorescence. CLON-G est efficace sur les neutrophiles de souris et d’humains; Cependant, les échantillons de souris sont présentés ici pour simplifier ce protocole. La concentration de NAC est de 1 mM pour les neutrophiles de souris et de 10 μM pour les neutrophiles humains. Hsp70 est spécifique à l’espèce et, par conséquent, devrait être utilisé en fonction de la source du neutrophile. Pour ce protocole, peu importe que les neutrophiles soient isolés du sang périphérique ou de la moelle osseuse et comment ils sont isolés.
Pour la présente étude, les neutrophiles ont été isolés de la moelle osseuse de souris pour obtenir suffisamment de neutrophiles pour les expériences, car environ 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrophiles peuvent être obtenus à partir de la moelle osseuse, tandis que seulement 1 x 10 6 neutrophiles peuvent être isolés du sang périphérique d’une seule souris C57BL/6 âgée de 8 à 12 semaines (de l’un ou l’autre sexe). La centrifugation par gradient a été réalisée pour éviter d’éventuels dommages et activations dus à la stimulation mécanique du tri FACS ou du tri MACS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4612</td>
			<td>Filtrate prepared CLON-G components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro centrifuge tube</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>MCT-001-150</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-15</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Neutrophil culture plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-50</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>Assitant of Annexin-V binding&#160; to phosphatidylserine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>UltraVIEW VOX</td>
			<td>Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801001-20mm</td>
			<td>Lab consumable for fluorescent image assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C36950</td>
			<td>Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide ( DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Annexin-V</td>
			<td>BD</td>
			<td>51-65874X</td>
			<td>Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113187</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Component of CLON-G. Antioxidant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nec-1s</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>852391-15-2</td>
			<td>Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421301</td>
			<td>For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA&#160; but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-VD-oph</td>
			<td>Selleck chem</td>
			<td>S7311</td>
			<td>Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)</td>
			<td>Chugai Pharma China</td>
			<td>GRANOCYTE</td>
			<td>Component of CLON-G.&#160; Promote neutrophil survival through Akt pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>100-0102</td>
			<td>Lab consumable for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>LEAGENE</td>
			<td>R00641</td>
			<td>Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>FENG CHUAN</td>
			<td>13-011-00029</td>
			<td>pH adjustion for NAC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1020</td>
			<td>Neutrophil cytospin staining.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay

La durée de vie moyenne d’un neutrophile est inférieure à 24 h, ce qui limite la recherche fondamentale sur les neutrophiles et l’application des études sur les neutrophiles. Nos recherches antérieures ont indiqué que de multiples voies pourraient intervenir dans la mort spontanée des neutrophiles. Un cocktail a été développé en ciblant simultanément ces voies, les caspases-perméabilisation-inhibition de la nécroptose de la membrane lysosomale et le facteur de stimulation des colonies de granulocytes (CLON-G), qui a prolongé la durée de vie des neutrophiles à plus de 5 jours sans compromettre de manière significative la fonction des neutrophiles. Parallèlement, un protocole fiable et stable pour évaluer la mort des neutrophiles a également été élaboré. Dans ce travail, nous montrons que CLON-G peut prolonger la durée de vie des neutrophiles in vitro à plus de 5 jours, et nous présentons l’allongement de la durée de vie des neutrophiles avec FACS et la microscopie confocale à fluorescence. Ce rapport présente des procédures pour la préparation du CLON-G et présente un essai in vitro de mort spontanée des neutrophiles, qui peut être utilisé pour l’étude des neutrophiles et pour interroger ensuite la mort des neutrophiles, fournissant ainsi une ressource fiable pour la communauté des neutrophiles.

La morphologie colorée Wright-Giemsa (Figure 2A-D) et les phénotypes FACS (Figure 2E-J) des neutrophiles traités par CLON-G n’ont pas été affectés. La viabilité des neutrophiles traités par CLON-G à 24 heures était d’environ 90%+ d’après l’analyse par cytométrie en flux (Figure 3) et les essais par image fluorescente (Figure ...

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Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

Ce protocole détaille la préparation de CLON-G pour prolonger la durée de vie des neutrophiles à plus de 5 jours et fournit une procédure fiable pour évaluer la mort des neutrophiles par cytométrie en flux et microscopie confocale à fluorescence.

Prolongation de la durée de vie des neutrophiles avec CLON-G et un test de mort spontanée in vitro

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

Notre protocole fournit un milieu cocktail pour prolonger la durée de vie des neutrophiles à plus de cinq jours sans compromettre les fonctions des neutrophiles. Il offre également une dialyse in vitro fiable pour les neutrophiles. Le traitement par CLON-G élargit les possibilités de préservation, de transport et de manipulation génétique des neutrophiles, ce qui peut accélérer la recherche dans la communauté des neutrophiles.Pour commencer, préparez le milieu de base en ajoutant RPMI 1640 FBS et stylo-streptocoque à un tube de 50 millilitres. Simultanément, décongelez toutes les solutions mères des composants CLON-G sur la glace. Diluer ensuite HSP 70 et 200 microgrammes par millilitre de G-CSF dans le milieu basique.Transférer 976 microlitres de milieu basique dans un tube centrifuge de 15 millilitres. À cela, ajoutez les composants CLON-G pour préparer un millilitre de milieu CLON-G 2x comme décrit dans le manuscrit. Ensuite, préparez la culture des neutrophiles en suspendant les neutrophiles de souris isolés dans le milieu de base.Ajouter le milieu CLON-G, suivi du milieu de base à 24 plaques de culture non tissulaire puits. Ajoutez ensuite 100 microlitres de la suspension cellulaire préparée et pipeter doucement trois à quatre fois. Incuber la plaque de culture à 37 degrés Celsius avec 5% d’apport de dioxyde de carbone.Colorer les neutrophiles cultivés avec du cytospin et les analyser à l’aide d’un microscope optique. Pour l’analyse par cytométrie en flux, ajoutez un millilitre de milieu cellulaire à la culture cellulaire de neutrophiles cultivée pendant la nuit. Mélanger le milieu de culture cellulaire en le pipetant doucement cinq à sept fois et transférer 100 microlitres de ce mélange dans un tube de cytométrie en flux aux points de temps souhaités.Simultanément, faire tourbillonner les billes de comptage et pipeter 10 microlitres de solution de billes sur le même tube de cytométrie en flux contenant le milieu cellulaire. Ajouter 10 microlitres d’un mélange de coloration pré-préparé à ce tube de cytométrie en flux et incuber pendant cinq minutes au réfrigérateur à la tombée de la nuit. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution saline dans le tube et mélangez bien pour une répartition uniforme des billes et des cellules de comptage.Enfin, effectuez l’analyse de cytométrie en flux de la suspension cellulaire comme décrit dans le manuscrit du texte. Pour le dosage des images fluorescentes, ajoutez deux millilitres de suspension cellulaire par plaque confocale et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pendant ce temps, dissoudre un gramme de chlorure de calcium dans 45 millilitres de solution saline et filtrer-le avec une unité de filtration de 0,2 micromètre.Retirez délicatement la plaque confocale au point de temps requis. Colorer les cellules avec 10 microlitres de FITC-Annexin-V, PI et chlorure de calcium pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, à l’aide d’un microscope confocale à fluorescence, capturez les images en utilisant les canaux souhaités.Dans la présente étude, la morphologie des neutrophiles n’a pas été affectée dans le milieu CLON-G, même après cinq jours. De plus, les phénotypes de fax ont démontré des cellules intactes après le traitement. L’analyse par cytométrie en flux a montré une population positive de neutrophiles non traités dans l’annexine-V et la perte de population pourrait être due à l’acide éthylène diamine tétraacétique dans le milieu cellulaire.Cependant, la viabilité des neutrophiles traités par CLON-G à 24 heures était d’environ plus de 90 %. Les tests d’image fluorescente ont également confirmé la viabilité cellulaire des neutrophiles traités par CLON-G. Les neutrophiles cultivés dans le milieu basique pendant 24 heures ont montré des cellules gonflées et la perte de ces cellules pourrait avoir résulté de l’agitation ou du pipetage de la plaque confocale. Les concentrations et les effets des composés CLON-G peuvent avoir un impact significatif sur les tests de neutrophiles.Dans la mesure du possible, évitez de les moduler. Les recherches sur les neutrophiles sont laborieuses, coûteuses et extrêmement limitées dans leur application clinique en raison de leur courte durée de vie. Cette méthode permet de surmonter partiellement ces obstacles.

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