Name: neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay
Uploaded: 2023-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay at JoVE.com

このプロジェクトは、細胞生態系イノベーション基金の海河研究所(22HHXBSS00036、22HHXBSS00019)、中国医学科学院(CAMS)医学イノベーション基金(2021-I2M-1-040、2022-I2M-JB-015)、中央大学特別研究基金、北京ユニオン医科大学(3332022062)、および四川省科学技術支援プログラム(NO.2021YJ0480)の支援を受けました。

ボストン小児病院および州立実験血液学重点研究所(SKLEH)動物管理および使用委員会は、すべての手順を承認および監視しました。 図1 は、CLON-Gによる好中球培養および インビトロ 死アッセイのフローチャートを示す。
1. CLON-Gによる好中球寿命延長
注意: 記載されているすべての操作と材料は無菌でなければ?...

好中球は自然免疫と適応免疫に重要な役割を果たしており、その恒常性は厳密に制御されています。好中球は、ヒト末梢血中に最も豊富な白血球であり、堅牢で速い代謝回転を有する。健康な成人は骨髄から毎日1 x 109好中球/ kgを放出することができます28。したがって、好中球の死はこの分野の不可解な謎の1つになり、好中球をよりよく理解するために多くの努力...

好中球は、豊富な細胞質顆粒、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)オキシダーゼ、抗菌酵素、および侵入微生物から保護するさまざまな細胞小器官の兵器庫を含むことが知られています。さらに、それらは非常に運動性が高く、炎症部位に動員される最初の細胞であり、好中球が自然免疫系の防御の第一線であることを意味します1,2。したがって、顆粒球輸血療法は、好中球免疫を一過性に高める好中球減少症関連感染症の有望な臨床治療法となっています3,4,5。最近の発見は、好中球が多くの生理病理学的シナリオにおいて多面的なエフェクターとしても機能することを明確に示しています6。好中球の平均寿命は24時間未満であり、したがって、好中球の基礎研究と好中球研究の適用は、安定した遺伝子操作と長期保存に関連する制限のために非常に困難です7,8,9,10,11 .HL-60、PLB-985、NB4、かすみ-1、人工多能性幹細胞など、好中球機能を部分的に示すことができる細胞株がいくつかあります12。これらの細胞株は、効果的な遺伝子編集と凍結保存を達成することができます。しかし、それらは依然として一次好中球とはかなり大きく異なるため、好中球機能を忠実に再現することはできません13。したがって、この分野の研究のほとんどは、依然として新たに単離された一次好中球に依存しています。この分野は、好中球の特定の遺伝子機能を調査するために、高価で時間のかかる条件付きノックアウトマウスの生成に依存していますが、現在、ヒトモデルは存在しません。
好中球死に関与する不均一なプロセスと、これらのプロセスを調節する複数の経路の探索に力を入れた結果14,15、CLON-G(カスパーゼ-リソソーム膜透過処理-酸化-ネクロトーシス阻害と顆粒球コロニー刺激因子)と呼ばれる新しい治療法が最近報告されました16。.CLON-Gは、Q-VD-oph(キノリル-バリル-O-メチルアスパルチル-[-2,6-ジフルオロフェノキシ]-メチルケトン)、Hsp70(ヒートショックタンパク質70)、DFO(デフェロキサミン)、NAC(N-アセチルシステイン)、Nec-1(ネクロスタチン-1)、およびG-CSF(顆粒球コロニー刺激因子)で構成されています。好中球の自然死は、アポトーシス、ネクロプトーシス、パイロトーシスなどの複数の経路によって媒介されます。Q-VD-ophは、カスパーゼ1、カスパーゼ3、カスパーゼ8、およびカスパーゼ9を標的とすることにより、汎カスパーゼ阻害剤としての好中球のアポトーシスを阻害します17。好中球ネクロトーシスは、受容体相互作用タンパク質キナーゼ-1(RIPK1)と混合系統キナーゼドメイン様タンパク質(MLKL)18が関与するシグナル伝達経路に依存しています。RIPK1阻害剤として、Nec-1は好中球のネクロトーシスを阻害します。Hsp70とDFOはリソソーム膜透過処理(LMP)を阻害し、好中球のアポトーシス19とパイロトーシス20を誘導する可能性があります。活性酸素種(ROS)は、LMP19とアポトーシス21を媒介し、生存シグナル22を阻害することにより、好中球の死に重要な役割を果たします。ROSの蓄積を減らすことができる抗酸化物質として、NACは好中球の死を遅らせます。成長因子として、G-CSFは好中球生存シグナルを活性化し、カルパイン誘発アポトーシスを阻害します23,24。複数の好中球の自然死経路を同時に標的とすることにより、好中球の寿命は、その機能を損なうことなく、効果的に5日以上に延長することができます。CLON-G治療は、好中球の保存、輸送、遺伝子操作の可能性を広げ、好中球コミュニティでの研究を加速することができます。一方、好中球死の知識に基づいて、現在承認されている細胞死アッセイのプロトコルは好中球に予期しない損傷を引き起こす可能性があるため14、これらのプロトコルは好中球研究により適したものに改良されています。このレポートは、CLON-Gによる好中球培養の詳細なプロトコルと、フローサイトメトリーと蛍光イメージングを使用したマウス好中球のin vitro細胞死アッセイを提供します。CLON-Gは、マウスとヒトの両方の好中球に有効です。ただし、ここでは、このプロトコルを簡略化するためにマウスのサンプルを示します。NACの濃度は、マウス好中球で1 mM、ヒト好中球で10 μMです。Hsp70は種特異的であるため、好中球の供給源に応じて利用する必要があります。このプロトコルでは、好中球が末梢血または骨髄から単離されているかどうか、およびそれらがどのように単離されるかは関係ありません。
本研究では、骨髄から約1 x 10 7-1.5 x10 7好中球を得ることができるため、マウス骨髄から好中球を単離し、1 x 10 6好中球のみを末梢血から単離することができます8-12週齢のC57BL /6マウス(性別のいずれか)。勾配遠心分離は、FACS選別またはMACS選別の機械的刺激による損傷および活性化の可能性を回避するために実施された。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4612</td>
			<td>Filtrate prepared CLON-G components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro centrifuge tube</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>MCT-001-150</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-15</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Neutrophil culture plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-50</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>Assitant of Annexin-V binding&#160; to phosphatidylserine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>UltraVIEW VOX</td>
			<td>Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801001-20mm</td>
			<td>Lab consumable for fluorescent image assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C36950</td>
			<td>Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide ( DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Annexin-V</td>
			<td>BD</td>
			<td>51-65874X</td>
			<td>Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113187</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Component of CLON-G. Antioxidant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nec-1s</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>852391-15-2</td>
			<td>Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421301</td>
			<td>For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA&#160; but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-VD-oph</td>
			<td>Selleck chem</td>
			<td>S7311</td>
			<td>Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)</td>
			<td>Chugai Pharma China</td>
			<td>GRANOCYTE</td>
			<td>Component of CLON-G.&#160; Promote neutrophil survival through Akt pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>100-0102</td>
			<td>Lab consumable for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>LEAGENE</td>
			<td>R00641</td>
			<td>Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>FENG CHUAN</td>
			<td>13-011-00029</td>
			<td>pH adjustion for NAC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1020</td>
			<td>Neutrophil cytospin staining.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay

好中球の平均寿命は24時間未満であり、好中球に関する基礎研究と好中球研究の適用が制限されています。私たちの以前の研究は、複数の経路が好中球の自然死を媒介する可能性があることを示しました。カスパーゼ-リソソーム膜透過-酸化-ネクロトーシス阻害と顆粒球コロニー刺激因子(CLON-G)を同時に標的としたカクテルを開発し、好中球機能を大幅に損なうことなく好中球の寿命を5日以上に延長しました。同時に、好中球死を評価および評価するための信頼性が高く安定したプロトコルも開発されました。本研究では、CLON-Gが in vitro で好中球の寿命を5日以上に延ばすことができることを示し、FACSと共焦点蛍光顕微鏡法を用いて好中球の寿命を延ばすことを示しました。このレポートでは、CLON-Gの調製手順を紹介し、好中球の研究とその後の好中球死の調査に使用できる好中球の in vitro 自然死アッセイを紹介し、好中球コミュニティに信頼できるリソースを提供します。

CLON-G処理好中球のライト-ギムザ染色形態(図2A-D)およびFACS表現型(図2E-J)は影響を受けなかった。24時間でのCLON-G処理好中球の生存率は、フローサイトメトリー分析(図3)および蛍光画像アッセイ(図4)に基づいて約90%+でした。生存率の低下は、不適切な保管...

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Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

このプロトコルは、好中球の寿命を5日以上に延長するためのCLON-Gの調製を詳述し、フローサイトメトリーと共焦点蛍光顕微鏡で好中球死を評価するための信頼できる手順を提供します。

CLON-Gおよび in vitro 自然死アッセイによる好中球の寿命延長

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

私たちのプロトコルは、好中球の機能を損なうことなく、好中球の寿命を5日以上に延長するためのカクテル培地を提供します。また、好中球のための信頼性の高い体外透析を提供します。CLON-G治療は、好中球の保存、輸送、遺伝子操作の可能性を広げ、好中球コミュニティでの研究を加速することができます。まず、RPMI 1640 FBSとペンストレプトを50ミリリットルのチューブに加えて、基本培地を準備します。同時に、CLON-G成分のすべてのストック溶液を氷上で解凍します。次に、基本培地でHSP 70および200マイクログラム/G-CSFを1ミリリットルに希釈します。976マイクロリットルの塩基性培地を15ミリリットルの遠沈管に移します。これにCLON-G成分を添加し、原稿に記載されているように1ミリリットルの2x CLON-G培地を調製します。次に、単離したマウス好中球を塩基性培地に懸濁して好中球培養液を調製する。CLON-G培地を添加し、続いて基本培地を24穴非組織培養プレートに添加する。次に、調製した細胞懸濁液100マイクロリットルを加え、3〜4回穏やかにピペッティングします。培養プレートを摂氏37度でインキュベートし、5%の二酸化炭素を供給します。培養した好中球をサイトスピンで染色し、光学顕微鏡で分析します。フローサイトメトリー分析では、一晩培養した好中球細胞培養液に1ミリリットルの細胞培地を加えます。細胞培養培地を5〜7回穏やかにピペッティングして混合し、この混合物100マイクロリットルを目的の時点でフローサイトメトリーチューブに移します。同時に、計数ビーズおよびピペット10マイクロリットルのビーズ溶液を細胞培地を含む同じフローサイトメトリーチューブにボルテックスする。予め調製した染色ミックス10マイクロリットルをこのフローサイトメトリーチューブに加え、暗所の冷蔵庫で5分間インキュベートします。次に、100マイクロリットルの生理食塩水をチューブに加え、よく混合して、カウントビーズとセルを均一に分散させます。最後に、テキスト原稿に記載されているように細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析を実行します。蛍光画像アッセイでは、共焦点プレートあたり2ミリリットルの細胞懸濁液を加え、摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。その間、1グラムの塩化カルシウムを45ミリリットルの生理食塩水に溶解し、0.2マイクロメートルのろ過ユニットでろ過します。必要な時点で共焦点プレートをそっと取り外します。細胞を10マイクロリットルのFITC-アネキシン-V、PIおよび塩化カルシウムで室温で5分間染色します。次に、共焦点蛍光顕微鏡を使用して、目的のチャネルを使用して画像をキャプチャします。本研究では、好中球の形態は5日後でもCLON-G培地で影響を受けませんでした。さらに、ファックス表現型は、処理後に無傷の細胞を示した。フローサイトメトリー分析では、Annexin-Vの未処理好中球の陽性集団が示され、集団の減少は細胞培地中のエチレンジアミン四酢酸に起因する可能性があります。しかし、24時間でのCLON-G処理好中球の生存率は約90%以上であり、蛍光画像アッセイでは、CLON-G処理好中球の細胞生存率も確認されました。基本培地で24時間培養された好中球は膨化細胞を示し、これらの細胞の喪失は共焦点プレートの振とうまたはピペッティングに起因する可能性があります。CLON-G化合物の濃度と効果は、好中球検査に大きな影響を与える可能性があります。可能であれば、それらを変調することは避けてください。好中球の調査は、寿命が短いため、手間がかかり、費用がかかり、臨床応用が非常に限られています。この方法は、これらの障害を部分的に克服します。

Research

JoVE Journal

Biology

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