Name: neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay
Uploaded: 2023-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay at JoVE.com

이 프로젝트는 하이허 세포 생태계 혁신 기금 연구소(22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), 중국 의학원(CAMS) 의료 과학 혁신 기금(2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), 중앙 대학 특별 연구 기금, 북경 연합 의과 대학(3332022062) 및 쓰촨성 과학 기술 지원 프로그램(NO. 2021YJ0480).

Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology(SKLEH) 동물 관리 및 사용 위원회는 모든 절차를 승인하고 모니터링했습니다. 도 1 은 CLON-G를 이용한 호중구 배양 및 시험관 내 사멸 분석의 흐름도를 나타낸 것이다.
1. CLON-G를 이용한 호중구 수명 연장
알림: 언급된 모든 작업 및 재료는 멸균되어야 합니다. ...

호중구는 선천성 면역과 후천성 면역에 중요한 역할을 하며, 호중구의 항상성은 엄격하게 조절됩니다. 호중구는 인간의 말초 혈액에서 가장 풍부한 백혈구이며 강력하고 빠른 회전율을 가지고 있습니다. 건강한 성인은 매일 1 x 109 호중구/kg을 골수에서 배출할 수 있다28. 따라서 호중구의 죽음은 이 분야의 수수께끼 같은 수수께끼 중 하나가 되었으며, 호중구를 더 잘 이?...

호중구는 풍부한 세포질 과립, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH) 산화효소, 항균 효소 및 침입하는 미생물을 방어하는 다양한 세포 기관의 무기고를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 또한, 그들은 운동성이 높고 염증 부위에 모집 된 첫 번째 세포이며, 이는 호중구가 선천성 면역계의 첫 번째 방어선임을 의미합니다 1,2. 따라서 과립구 수혈 요법은 호중구 면역을 일시적으로 증가시키기 위해 호중구 감소증 관련 감염에 대한 유망한 임상 치료법이 되었다 3,4,5. 최근의 발견은 호중구가 많은 생리병리학적 시나리오에서 다면적 효과기로도 기능한다는 것을 분명히 보여주었다6. 호중구의 평균 수명은 24시간 미만이며, 따라서 호중구에 대한 기초 연구와 호중구 연구의 적용은 안정적인 유전자 조작 및 장기 저장과 관련된 한계로 인해 매우 어렵습니다 7,8,9,10,11 . HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 및 유도만능줄기세포(12)와 같은 일부 호중구 기능을 부분적으로 나타낼 수 있는 세포주가 있다. 이러한 세포주는 효과적인 유전자 편집 및 냉동 보존을 달성할 수 있습니다. 그러나 그것들은 여전히 일차 호중구와 상당히 다르기 때문에 호중구 기능을 충실하게 요약할 수 없다13. 따라서 이 분야의 대부분의 연구는 여전히 새로 분리된 1차 호중구에 의존합니다. 이 분야는 여전히 호중구의 특정 유전자 기능을 조사하기 위해 비용과 시간이 많이 소요되는 조건부 녹아웃 마우스를 생성하는 데 의존하지만 현재 인간 모델은 존재하지 않습니다.
호중구 사멸과 관련된 이질적인 과정과 이러한 과정을 조절하는 여러 경로를 탐구하기 위해 노력한 결과,14,15, CLON-G(카스파제-리소좀 막 투과화-산화제-괴사 억제 및 과립구 집락 자극 인자)라는 새로운 치료법이 최근 보고되었다16. CLON-G는 Q-VD-oph(퀴놀릴-발릴-O-메틸아스파르틸-[-2,6-디플루오로페녹시]-메틸 케톤), Hsp70(열충격 단백질 70), DFO(데페록사민), NAC(N-아세틸시스테인), Nec-1s(네크로스타틴-1s) 및 G-CSF(과립구 콜로니 자극 인자). 호중구 자연사는 세포자멸사, 괴사증 및 파이롭토시스를 포함한 여러 경로에 의해 매개됩니다. Q-VD-oph는 카스파아제 1, 카스파아제 3, 카스파아제 8, 카스파아제 9를 표적으로 하여 pan-카스파아제 억제제로서 호중구의 세포자멸사를 억제한다17. 호중구 괴사는 수용체 상호작용 단백질 키나아제-1(RIPK1) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사 단백질(MLKL)18을 포함하는 신호 전달 경로에 의존합니다. RIPK1 억제제로서 Nec-1s는 호중구의 괴사를 억제합니다. Hsp70 및 DFO는 리소좀 막 투과화(LMP)를 억제할 수 있으며, 이는 호중구 세포자멸사(hotrophil apoptosis)19 및 파이롭토시스(pyroptosis)20를 유도할 수 있다. 활성산소종(ROS)은LMP19와 세포자멸사를 매개하고 생존 신호(22)를 억제함으로써 호중구 사멸에 중요한 역할을 한다. ROS 축적을 줄일 수 있는 항산화제인 NAC는 호중구 사멸을 지연시킵니다. 성장 인자로서 G-CSF는 호중구 생존 신호를 활성화하고 칼파인 유도 세포 사멸을 억제합니다23,24. 여러 호중구 자발적 사망 경로를 동시에 표적으로 삼음으로써 호중구 수명을 기능 저하 없이 5일 이상으로 효과적으로 연장할 수 있습니다. CLON-G 치료는 호중구 보존, 수송 및 유전자 조작의 가능성을 확장하여 호중구 군집에서의 연구를 가속화할 수 있습니다. 한편, 호중구 사멸에 대한 지식에 기초하여, 세포 사멸 분석을 위해 현재 승인된 프로토콜은 호중구(14)에 예기치 않은 손상을 일으킬 수 있으므로, 이들 프로토콜은 호중구 연구에 더 적합하도록 개선되었다. 이 보고서는 CLON-G를 사용한 호중구 배양과 유세포 분석 및 형광 이미징을 사용한 마우스 호중구의 시험관 내 세포 사멸 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. CLON-G는 마우스와 인간 호중구 모두에 효과적입니다. 그러나 이 프로토콜을 단순화하기 위해 마우스 샘플이 여기에 설명되어 있습니다. NAC의 농도는 마우스 호중구의 경우 1mM이고 인간 호중구의 경우 10μM입니다. Hsp70은 종 특이적이므로 호중구의 공급원에 따라 활용되어야 합니다. 이 프로토콜의 경우 호중구가 말초 혈액 또는 골수에서 분리되는지 여부와 분리 방법은 중요하지 않습니다.
본 연구를 위해, 호중구는 실험을 위한 충분한 호중구를 달성하기 위해 마우스 골수로부터 분리되었는데, 이는 약 1 x 10 7-1.5 x 107 호중구가 골수로부터 얻어질 수 있는 반면, 단지 1 x 10 6 호중구만이 단일 8-12주령 C57BL/6 마우스(성별 모두)의 말초 혈액으로부터 분리될 수 있기 때문이다. 구배 원심분리는 FACS 분류 또는 MACS 분류의 기계적 자극으로부터 가능한 손상 및 활성화를 피하기 위해 수행되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4612</td>
			<td>Filtrate prepared CLON-G components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro centrifuge tube</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>MCT-001-150</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-15</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Neutrophil culture plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-50</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>Assitant of Annexin-V binding&#160; to phosphatidylserine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>UltraVIEW VOX</td>
			<td>Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801001-20mm</td>
			<td>Lab consumable for fluorescent image assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C36950</td>
			<td>Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide ( DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Annexin-V</td>
			<td>BD</td>
			<td>51-65874X</td>
			<td>Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113187</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Component of CLON-G. Antioxidant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nec-1s</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>852391-15-2</td>
			<td>Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421301</td>
			<td>For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA&#160; but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-VD-oph</td>
			<td>Selleck chem</td>
			<td>S7311</td>
			<td>Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)</td>
			<td>Chugai Pharma China</td>
			<td>GRANOCYTE</td>
			<td>Component of CLON-G.&#160; Promote neutrophil survival through Akt pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>100-0102</td>
			<td>Lab consumable for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>LEAGENE</td>
			<td>R00641</td>
			<td>Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>FENG CHUAN</td>
			<td>13-011-00029</td>
			<td>pH adjustion for NAC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1020</td>
			<td>Neutrophil cytospin staining.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay

호중구의 평균 수명은 24시간 미만으로 호중구에 대한 기초 연구와 호중구 연구의 적용을 제한합니다. 우리의 이전 연구는 여러 경로가 호중구의 자발적인 죽음을 매개할 수 있음을 나타냅니다. 카스파제-리소좀 막 투과-산화제-괴사 억제와 과립구 집락 자극 인자(CLON-G)와 같은 경로를 동시에 표적으로 삼아 칵테일을 개발하여 호중구 기능을 크게 손상시키지 않으면서 호중구 수명을 5일 이상으로 연장했습니다. 동시에 호중구 사망을 평가하고 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 안정적인 프로토콜도 개발되었습니다. 본 연구에서는 CLON-G가 시험관 내에서 호중구의 수명을 5일 이상으로 연장할 수 있음을 보여주고, FACS 및 공초점 형광현미경을 통해 호중구의 수명을 연장하는 것을 보여줍니다. 이 보고서는 CLON-G 준비 절차를 소개하고 호중구 연구 및 후속 호중구 사멸 조사에 사용할 수 있는 호중구의 시험관 내 자연 사망 분석을 보여줌으로써 호중구 커뮤니티에 신뢰할 수 있는 리소스를 제공합니다.

CLON-G 처리된 호중구의 Wright-Giemsa-염색 형태(도 2A-D) 및 FACS 표현형(도 2E-J)은 영향을 받지 않았습니다. 24시간에서 CLON-G 처리된 호중구의 생존율은 유세포 분석 분석(그림 3) 및 형광 이미지 분석(그림 4)을 기반으로 약 90%+였습니다. 낮은 생존율은 부적절한 보...

Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay at JoVE.com

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

이 프로토콜은 호중구 수명을 5일 이상으로 연장하기 위한 CLON-G의 준비를 자세히 설명하고 유세포 분석 및 공초점 형광 현미경으로 호중구 사멸을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 절차를 제공합니다.

CLON-G 및 In Vitro Spontaneous Death Assay를 통한 호중구 수명 연장

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

우리의 프로토콜은 호중구 기능을 손상시키지 않으면서 호중구 수명을 5일 이상으로 연장하는 칵테일 배지를 제공합니다. 또한 호중구에 대한 신뢰할 수 있는 체외 투석을 제공합니다. CLON-G 치료는 호중구 보존, 수송 및 유전자 조작의 가능성을 확장하여 호중구 군집에서의 연구를 가속화할 수 있습니다.시작하려면 RPMI 1640 FBS와 펜 스트렙을 50밀리리터 튜브에 추가하여 기본 배지를 준비합니다. 동시에 CLON-G 구성품의 모든 원액을 얼음 위에서 해동합니다. 그런 다음 기본 배지에서 G-CSF 밀리리터당 HSP 70 및 200 마이크로 그램을 희석하십시오.976마이크로리터의 기본 매체를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 여기에 CLON-G 구성 요소를 추가하여 원고에 설명된 대로 1밀리리터의 2x CLON-G 배지를 준비합니다. 다음으로, 분리된 마우스 호중구를 염기성 배지에 현탁하여 호중구 배양물을 준비한다.CLON-G 배지를 첨가하고, 염기성 배지를 24웰 비조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 그런 다음 준비된 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 넣고 부드럽게 3-4 회 피펫합니다. 배양 접시를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 공급으로 배양합니다.배양된 호중구를 사이토스핀으로 염색하고 광학 현미경을 사용하여 분석합니다. 유세포 분석을 위해, 하룻밤 동안 성장한 호중구 세포 배양액에 1밀리리터의 세포 배지를 첨가한다. 세포 배양 배지를 5-7회 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 이 혼합물 100마이크로리터를 원하는 시점에 유세포 분석 튜브에 옮깁니다.동시에, 계수 비드 및 10 마이크로리터의 비드 용액을 함유하는 동일한 세포 배지를 함유하는 동일한 유세포 분석 튜브에 와동시킨다. 미리 준비된 염색 혼합물 10마이크로리터를 이 유세포 분석 튜브에 넣고 어두운 곳에서 냉장고에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 식염수를 튜브에 넣고 계수 비드와 세포의 균일한 분포를 위해 잘 혼합합니다.마지막으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 세포 현탁액의 유세포 분석을 수행합니다. 형광 이미지 분석의 경우 컨포칼 플레이트당 2밀리리터의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 한편, 45 밀리리터의 식염수에 1 그램의 염화칼슘을 녹이고 0.2 마이크로 미터 여과 장치로 여과한다.필요한 시점에서 컨포칼 플레이트를 부드럽게 제거합니다. 실온에서 5분 동안 10마이크로리터의 FITC-Annexin-V, PI 및 염화칼슘으로 세포를 염색합니다. 그런 다음 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 원하는 채널을 사용하여 이미지를 캡처합니다.본 연구에서는 5일 후에도 CLON-G 배지에서 호중구의 형태가 영향을 받지 않았다. 또한, 팩스 표현형은 치료 후 손상되지 않은 세포를 나타냈다. 유세포 분석 결과 Annexin-V에서 처리되지 않은 호중구의 양성 집단이 나타났으며 집단 손실은 세포 배지의 에틸렌 디아민 테트라아세트산으로 인한 것일 수 있습니다.그러나 24시간째 CLON-G 처리된 호중구의 생존율은 약 90% 이상이었고, 형광 이미지 분석법에서도 CLON-G 처리된 호중구의 세포 생존율을 확인할 수 있었습니다. 염기성 배지에서 24시간 동안 배양된 호중구는 부풀어 오른 세포를 보였으며 이러한 세포의 손실은 공초점 플레이트의 흔들림 또는 피펫팅으로 인해 발생했을 수 있습니다. CLON-G 화합물 농도 및 효과는 호중구 검사에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.가능하면 변조하지 마십시오. 호중구 조사는 힘들고 비용이 많이 들며 수명이 짧기 때문에 임상 적용이 극히 제한적입니다. 이 방법은 이러한 장애물을 부분적으로 극복합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila

Proboscis Extension Response PER Assay in Drosophila

Drosophila의 코 확장 응답 (당) 어세이

Proboscis extension response (PER) is a taste behavior assay that has been used in flies as well as in honeybees.
On the surface of the fly's mouth ...

연구

생물학

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

체외에서 FluoroBlok 종양의 침략 분석

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

A ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

β - glucuronidase (거스)을 기반으로 세포를 파괴 분석

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

의 수명 측정<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

생분해 성 플라스틱 뿌리 덮개 필름을 부셔 가능성이있는 기본 토양 미생물의 분리가 농업에 사용

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

꿀벌 조직의 조직학 기초 및 세포 사멸 검출

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Chemiluminescence Assay를 통한 벼의 면역 반응에서 활성 산소 종 생산의 실시간 검출

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...