Name: neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay
Uploaded: 2023-05-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay at JoVE.com

Este projeto foi apoiado pelo Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), pelo Fundo de Inovação para Ciências Médicas da Academia Chinesa de Ciências Médicas (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), pelo Fundo Especial de Pesquisa para Universidades Centrais, pela Faculdade de Medicina da União de Pequim (3332022062) e pelo Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (NO. 2021YJ0480).

O Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Boston Children's Hospital and State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) aprovou e monitorou todos os procedimentos. A Figura 1 apresenta o fluxograma da cultura de neutrófilos com CLON-G e o ensaio de morte in vitro .
1. Extensão da vida útil dos neutrófilos com CLON-G
NOTA: Todas as operações e materiais mencionados devem ser estéreis. Certifique-se...

Os neutrófilos desempenham papéis vitais na imunidade inata e adaptativa, e sua homeostase é fortemente regulada. Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico humano e têm um turnover robusto e rápido. Um adulto saudável pode liberar 1 x 109 neutrófilos/kg diariamente da medula óssea28. A morte dos neutrófilos tornou-se, portanto, um dos enigmas intrigantes desse campo, e muito esforço tem sido dedicado para melhor compreendê-los. Acredita-se que ...

Os neutrófilos são conhecidos por compreender um arsenal de grânulos citoplasmáticos abundantes, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, enzimas antimicrobianas e várias organelas que defendem contra micróbios invasores; Além disso, são altamente móveis e são as primeiras células recrutadas para o local da inflamação, ou seja, os neutrófilos são a primeira linha de defesa do sistema imune inato 1,2. A terapia de transfusão de granulócitos tornou-se, portanto, um tratamento clínico promissor para infecções relacionadas à neutropenia para aumentar transitoriamente a imunidade neutrofílica 3,4,5. Descobertas recentes têm mostrado claramente que os neutrófilos também funcionam como efetores multifacetados em muitos cenários fisiopatológicos6. O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 h e, portanto, a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos de neutrófilos são tremendamente difíceis devido às limitações relacionadas à manipulação genética estável e ao armazenamento a longo prazo 7,8,9,10,11 . Existem algumas linhagens celulares que podem apresentar parcialmente algumas funções neutrófilas, como HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 e células-tronco pluripotentesinduzidas12. Essas linhagens celulares podem alcançar edição gênica e criopreservação; no entanto, eles ainda diferem imensamente dos neutrófilos primários e, portanto, não podem recapitular fielmente as funções dos neutrófilos13. Assim, a maior parte da pesquisa nesse campo ainda se baseia em neutrófilos primários recém-isolados. O campo ainda depende da geração de camundongos knock-out condicionais caros e demorados para investigar funções gênicas específicas em neutrófilos, mas nenhum modelo humano existe atualmente.
Tendo nos empenhado em explorar os processos heterogêneos envolvidos na morte de neutrófilos e as múltiplas vias que regulam esses processos14,15, um novo tratamento denominado CLON-G (caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-inibição da necroptose mais fator estimulador de colônias de granulócitos) foi recentemente relatado 16. O CLON-G consiste em Q-VD-oph (quinolil-valil-O-metilaspartil-[-2,6-difluorofenoxi]-metil cetona), Hsp70 (proteína de choque térmico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteína), Nec-1s (necrostatina-1s) e G-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos). A morte espontânea dos neutrófilos é mediada por múltiplas vias, incluindo apoptose, necroptose e piroptose. A Q-VD-OPH inibe a apoptose de neutrófilos como inibidor da pan-caspase, tendo como alvo a caspase 1, caspase 3, caspase 8 e caspase9 17. A necroptose neutrofílica é dependente de uma via de sinalização envolvendo a proteína quinase-1 de interação com o receptor (RIPK1) e a proteína de domínio semelhante ao domínio da linhagem mista de linhagem quinase (MLKL)18. Como um inibidor de RIPK1, Nec-1s inibem a necroptose de neutrófilos. Hsp70 e DFO podem inibir a permeabilização da membrana lisossômica (LMP), o que poderia induzir apoptose neutrofílica19 e piroptose20. As espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenham papéis vitais na morte de neutrófilos, mediando LMP19 e apoptose21 e inibindo sinais de sobrevivência22. Como um antioxidante que pode reduzir o acúmulo de EROs, NAC retarda a morte de neutrófilos. Como fator de crescimento, o G-CSF ativa sinais de sobrevivência de neutrófilos e inibe a apoptose induzida pela calpaína23,24. Ao visar simultaneamente múltiplas vias de morte espontânea de neutrófilos, o tempo de vida dos neutrófilos pode ser efetivamente estendido para mais de 5 dias sem comprometer sua função. O tratamento com CLON-G amplia as possibilidades de preservação, transporte e manipulação gênica de neutrófilos, o que pode acelerar a pesquisa na comunidade de neutrófilos. Enquanto isso, com base no conhecimento da morte de neutrófilos, os protocolos atualmente aprovados para ensaios de morte celular podem causar danos inesperados aos neutrófilos14, de modo que esses protocolos foram refinados para serem mais apropriados para estudos com neutrófilos. Este relatório fornece protocolos detalhados para cultura de neutrófilos com CLON-G e um ensaio in vitro de morte celular de neutrófilos de camundongos usando citometria de fluxo e imagem de fluorescência. O CLON-G é eficaz em neutrófilos humanos e de camundongos; no entanto, as amostras de camundongos são demonstradas aqui para simplificar esse protocolo. A concentração de NAC é de 1 mM para neutrófilos de camundongos e 10 μM para neutrófilos humanos. A Hsp70 é espécie-específica e, portanto, deve ser utilizada de acordo com a fonte do neutrófilo. Para este protocolo, não importa se os neutrófilos são isolados do sangue periférico ou da medula óssea e como são isolados.
Para o presente estudo, os neutrófilos foram isolados da medula óssea de camundongos para obter neutrófilos suficientes para os experimentos, pois cerca de 1 x 10 7-1,5 x 107 neutrófilos podem ser obtidos da medula óssea, enquanto apenas 1 x 10 6 neutrófilos podem ser isolados do sangue periférico de um único camundongo C57BL/6 de 8-12 semanas de idade (de ambos os sexos). A centrifugação por gradiente foi realizada para evitar possíveis danos e ativação a partir da estimulação mecânica da classificação FACS ou MACS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4612</td>
			<td>Filtrate prepared CLON-G components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro centrifuge tube</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>MCT-001-150</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-15</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Neutrophil culture plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-50</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>Assitant of Annexin-V binding&#160; to phosphatidylserine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>UltraVIEW VOX</td>
			<td>Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801001-20mm</td>
			<td>Lab consumable for fluorescent image assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C36950</td>
			<td>Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide ( DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Annexin-V</td>
			<td>BD</td>
			<td>51-65874X</td>
			<td>Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113187</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Component of CLON-G. Antioxidant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nec-1s</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>852391-15-2</td>
			<td>Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421301</td>
			<td>For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA&#160; but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-VD-oph</td>
			<td>Selleck chem</td>
			<td>S7311</td>
			<td>Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)</td>
			<td>Chugai Pharma China</td>
			<td>GRANOCYTE</td>
			<td>Component of CLON-G.&#160; Promote neutrophil survival through Akt pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>100-0102</td>
			<td>Lab consumable for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>LEAGENE</td>
			<td>R00641</td>
			<td>Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>FENG CHUAN</td>
			<td>13-011-00029</td>
			<td>pH adjustion for NAC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1020</td>
			<td>Neutrophil cytospin staining.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay

O tempo médio de vida de um neutrófilo é inferior a 24 horas, o que limita a pesquisa básica sobre neutrófilos e a aplicação de estudos com neutrófilos. Nossa pesquisa anterior indicou que múltiplas vias poderiam mediar a morte espontânea de neutrófilos. Um coquetel foi desenvolvido visando simultaneamente essas vias, caspases-membrana lisossômica permeabilização-oxidante-necroptose inibição mais fator estimulador de colônias de granulócitos (CLON-G), que prolongou a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias sem comprometer significativamente a função dos neutrófilos. Concomitantemente, um protocolo confiável e estável para avaliação e avaliação da morte de neutrófilos também foi desenvolvido. Neste trabalho, mostramos que o CLON-G pode prolongar a vida útil dos neutrófilos in vitro para mais de 5 dias, e exibimos o prolongamento da vida útil dos neutrófilos com FACS e microscopia de fluorescência confocal. Este relato introduz procedimentos para a preparação de CLON-G e mostra um ensaio in vitro de morte espontânea de neutrófilos, que pode ser usado para o estudo de neutrófilos e para subsequentemente interrogar a morte de neutrófilos, fornecendo assim um recurso confiável para a comunidade de neutrófilos.

A morfologia corada por Wright-Giemsa (Figura 2A-D) e os fenótipos FACS (Figura 2E-J) dos neutrófilos tratados com CLON-G não foram afetados. A viabilidade dos neutrófilos tratados com CLON-G em 24 h foi de cerca de 90%+ com base na análise por citometria de fluxo (Figura 3) e nos ensaios de imagem fluorescente (Figura 4). Menor vi...

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Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

Este protocolo detalha a preparação do CLON-G para estender a vida útil dos neutrófilos para mais de 5 dias e fornece um procedimento confiável para avaliar a morte de neutrófilos com citometria de fluxo e microscopia de fluorescência confocal.

Extensão da vida útil dos neutrófilos com CLON-G e ensaio de morte espontânea in vitro

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

Nosso protocolo fornece um meio de coquetel para prolongar a vida útil dos neutrófilos para mais de cinco dias sem comprometer as funções dos neutrófilos. Também oferece diálise in vitro confiável para neutrófilos. O tratamento com CLON-G amplia as possibilidades de preservação, transporte e manipulação gênica de neutrófilos, o que pode acelerar a pesquisa na comunidade de neutrófilos.Para começar, prepare o meio básico adicionando RPMI 1640 FBS e pen-strep a um tubo de 50 mililitros. Simultaneamente, descongelar todas as soluções estoque dos componentes CLON-G no gelo. Em seguida, diluir HSP 70 e 200 microgramas por mililitro de G-CSF no meio básico.Transfira 976 microlitros de meio básico para um tubo centrífugo de 15 mililitros. Para isso, adicione os componentes CLON-G para preparar um mililitro de meio CLON-G 2x conforme descrito no manuscrito. Em seguida, preparar a cultura de neutrófilos suspendendo os neutrófilos isolados de camundongos no meio básico.Adicionar o meio CLON-G, seguido do meio básico, a 24 placas bem não cultivadas em tecido. Em seguida, adicione 100 microlitros da suspensão de células preparada e pipete suavemente de três a quatro vezes. Incubar a placa de cultura a 37 graus Celsius com fornecimento de 5% de dióxido de carbono.Colorir os neutrófilos cultivados com cytospin e analisá-los usando um microscópio de luz. Para análise por citometria de fluxo, adicione um mililitro de meio celular à cultura de células de neutrófilos cultivada durante a noite. Misturar o meio de cultura celular pipetando-o suavemente cinco a sete vezes e transferir 100 microlitros dessa mistura para um tubo de citometria de fluxo nos momentos desejados.Simultaneamente, vórtice as esferas de contagem e pipeta de 10 microlitros de solução de esferas para o mesmo tubo de citometria de fluxo contendo meio celular. Adicione 10 microlitros de uma mistura de coloração pré-preparada a este tubo de citometria de fluxo e incube por cinco minutos na geladeira sob escuro. Em seguida, adicione 100 microlitros de soro fisiológico ao tubo e misture bem para uma distribuição uniforme das esferas e células de contagem.Por fim, realizar a análise por citometria de fluxo da suspensão celular conforme descrito no texto manuscrito. Para o ensaio de imagens fluorescentes, adicionar dois mililitros de suspensão celular por placa confocal e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Enquanto isso, dissolva um grama de cloreto de cálcio em 45 mililitros de soro fisiológico e filtre-o com uma unidade de filtragem de 0,2 micrômetro.Remova suavemente a placa confocal no ponto de tempo necessário. Corar as células com 10 microlitros de CTFI-Anexina-V, PI e cloreto de cálcio por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, usando um microscópio de fluorescência confocal, capture as imagens usando os canais desejados.No presente estudo, a morfologia dos neutrófilos não foi afetada no meio CLON-G mesmo após cinco dias. Além disso, os fenótipos de fax demonstraram células intactas após o tratamento. A análise por citometria de fluxo mostrou uma população positiva de neutrófilos não tratados em Anexina-V e a perda populacional pode ser devida ao ácido etilenodiaminotetracético no meio celular.No entanto, a viabilidade dos neutrófilos tratados com CLON-G em 24 horas foi de aproximadamente mais de 90%Os ensaios de imagem fluorescente também confirmaram a viabilidade celular dos neutrófilos tratados com CLON-G. Os neutrófilos cultivados no meio básico por 24 horas apresentaram células inchadas e a perda dessas células pode ter sido decorrente da agitação ou pipetagem da placa confocal. As concentrações e os efeitos do composto CLON-G podem afetar significativamente os testes de neutrófilos.Se possível, evite modulá-los. As investigações com neutrófilos são trabalhosas, caras e extremamente limitadas em aplicação clínica devido ao seu curto tempo de vida. Esse método supera parcialmente esses obstáculos.

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