Name: neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay
Uploaded: 2023-05-12T13:00:00
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Este proyecto fue apoyado por el Fondo de Innovación del Laboratorio de Ecosistemas Celulares de Haihe (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), el Fondo de Innovación para Ciencias Médicas de la Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), el Fondo Especial de Investigación para Universidades Centrales, el Colegio Médico de la Unión de Pekín (3332022062) y el Programa de Apoyo a la Ciencia y la Tecnología de la Provincia de Sichuan (NO. 2021YJ0480).

El Boston Children's Hospital y el Comité Estatal de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio Clave de Hematología Experimental (SKLEH) aprobaron y supervisaron todos los procedimientos. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo del cultivo de neutrófilos con CLON-G y el ensayo de muerte in vitro .
1. Extensión de la vida útil de los neutrófilos con CLON-G
NOTA: Todas las operaciones y materiales mencionado...

Los neutrófilos desempeñan un papel vital en la inmunidad innata y adaptativa, y su homeostasis está estrictamente regulada. Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre periférica humana, y tienen un recambio robusto y rápido. Un adulto sano puede liberar 1 x 109 neutrófilos/kg diarios de la médula ósea28. La muerte de los neutrófilos se ha convertido así en uno de los enigmas desconcertantes de este campo, y se ha dedicado mucho esfuerzo a comprenderlos m...

Se sabe que los neutrófilos comprenden un arsenal de abundantes gránulos citoplasmáticos, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa, enzimas antimicrobianas y varios orgánulos que defienden contra los microbios invasores; Además, son altamente móviles y son las primeras células reclutadas en el sitio de inflamación, lo que significa que los neutrófilos son la primera línea de defensa del sistema inmune innato 1,2. Por lo tanto, la terapia de transfusión de granulocitos se ha convertido en un tratamiento clínico prometedor para las infecciones relacionadas con neutropenia para aumentar transitoriamente la inmunidad de los neutrófilos 3,4,5. Descubrimientos recientes han demostrado claramente que los neutrófilos también funcionan como efectores multifacéticos en muchos escenarios fisiopatológicos6. El promedio de vida de un neutrófilo es inferior a 24 h y, por lo tanto, la investigación básica sobre neutrófilos y la aplicación de estudios de neutrófilos son tremendamente difíciles debido a las limitaciones relacionadas con la manipulación genética estable y el almacenamiento a largo plazo 7,8,9,10,11 . Hay algunas líneas celulares que pueden mostrar parcialmente algunas funciones de neutrófilos, como HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 y células madre pluripotentes inducidas12. Estas líneas celulares pueden lograr una edición y criopreservación de genes efectivas; Sin embargo, todavía difieren enormemente de los neutrófilos primarios y, por lo tanto, no pueden recapitular fielmente las funciones de los neutrófilos13. Por lo tanto, la mayor parte de la investigación en este campo todavía se basa en neutrófilos primarios recién aislados. El campo todavía se basa en la generación de ratones knock-out condicionales costosos y lentos para investigar funciones genéticas específicas en neutrófilos, pero actualmente no existen modelos humanos.
Habiendo puesto nuestro esfuerzo en explorar los procesos heterogéneos involucrados en la muerte de neutrófilos y las múltiples vías que regulan estos procesos14,15, recientemente se ha descrito un nuevo tratamiento denominado CLON-G (caspasas-permeabilización de membrana lisosomal-inhibición de la necroptosis oxidante más factor estimulante de colonias de granulocitos) 16. CLON-G consiste en Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartil-[-2,6-difluorophenoxy]-methyl ketone), Hsp70 (proteína de choque térmico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteína), Nec-1s (necrostatina-1s) y G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos). La muerte espontánea de neutrófilos está mediada por múltiples vías, incluyendo apoptosis, necroptosis y piroptosis. Q-VD-oph inhibe la apoptosis de los neutrófilos como un inhibidor de pan-caspasa al dirigirse a la caspasa 1, caspasa 3, caspasa 8 y caspasa9 17. La necroptosis de neutrófilos depende de una vía de señalización que involucra la proteína quinasa-1 que interactúa con el receptor (RIPK1) y la proteína similar al dominio de la quinasa de linaje mixto (MLKL)18. Como inhibidor de RIPK1, los Nec-1 inhiben la necroptosis de los neutrófilos. Hsp70 y DFO pueden inhibir la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP), lo que podría inducir la apoptosis de neutrófilos19 y la piroptosis20. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel vital en la muerte de neutrófilos al mediar LMP19 y apoptosis21 e inhibir las señales de supervivencia22. Como antioxidante que puede reducir la acumulación de ROS, NAC retrasa la muerte de neutrófilos. Como factor de crecimiento, el G-CSF activa las señales de supervivencia de los neutrófilos e inhibe la apoptosis inducida por calpaína23,24. Al dirigirse simultáneamente a múltiples vías de muerte espontánea de neutrófilos, la vida útil de los neutrófilos puede extenderse efectivamente a más de 5 días sin comprometer su función. El tratamiento con CLON-G amplía las posibilidades de preservación, transporte y manipulación de genes de neutrófilos, lo que puede acelerar la investigación en la comunidad de neutrófilos. Mientras tanto, con base en el conocimiento de la muerte de neutrófilos, los protocolos actualmente aprobados para los ensayos de muerte celular pueden causar daños inesperados a los neutrófilos14, por lo que estos protocolos se han refinado para ser más apropiados para los estudios de neutrófilos. Este informe proporciona protocolos detallados para el cultivo de neutrófilos con CLON-G y un ensayo de muerte celular in vitro de neutrófilos de ratón utilizando citometría de flujo e imágenes de fluorescencia. CLON-G es eficaz tanto en neutrófilos de ratón como humanos; Sin embargo, aquí se demuestran las muestras de ratón para simplificar este protocolo. La concentración de NAC es de 1 mM para neutrófilos de ratón y de 10 μM para neutrófilos humanos. Hsp70 es específico de la especie y, por lo tanto, debe utilizarse de acuerdo con la fuente del neutrófilo. Para este protocolo, no importa si los neutrófilos se aíslan de la sangre periférica o de la médula ósea y cómo se aíslan.
Para el presente estudio, se aislaron neutrófilos de médula ósea de ratón para lograr suficientes neutrófilos para los experimentos, ya que se pueden obtener aproximadamente 1 x 10 7-1.5 x 107 neutrófilos de la médula ósea, mientras que solo se pueden aislar 1 x 10 6 neutrófilos de la sangre periférica de un solo ratón C57BL /6 de 8-12 semanas de edad (de cualquier sexo). La centrifugación por gradiente se llevó a cabo para evitar posibles daños y activación por la estimulación mecánica de la clasificación FACS o la clasificación MACS.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4612</td>
			<td>Filtrate prepared CLON-G components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro centrifuge tube</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>MCT-001-150</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-15</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351147</td>
			<td>Neutrophil culture plate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>CT-002-50</td>
			<td>Lab consumable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>Assitant of Annexin-V binding&#160; to phosphatidylserine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Perkinelmer</td>
			<td>UltraVIEW VOX</td>
			<td>Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal plate</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801001-20mm</td>
			<td>Lab consumable for fluorescent image assay.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C36950</td>
			<td>Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide ( DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141C</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Annexin-V</td>
			<td>BD</td>
			<td>51-65874X</td>
			<td>Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hsp70</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113187</td>
			<td>Component of CLON-G. LMP inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Component of CLON-G. Antioxidant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nec-1s</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>852391-15-2</td>
			<td>Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (PS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421301</td>
			<td>For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA&#160; but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-VD-oph</td>
			<td>Selleck chem</td>
			<td>S7311</td>
			<td>Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF)</td>
			<td>Chugai Pharma China</td>
			<td>GRANOCYTE</td>
			<td>Component of CLON-G.&#160; Promote neutrophil survival through Akt pathway.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>100-0102</td>
			<td>Lab consumable for flow cytometry analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td>Component of neutrophil culture basic medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>LEAGENE</td>
			<td>R00641</td>
			<td>Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>FENG CHUAN</td>
			<td>13-011-00029</td>
			<td>pH adjustion for NAC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1020</td>
			<td>Neutrophil cytospin staining.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil lifespan extension with clon-g and an in vitro spontaneous death assay

El promedio de vida de un neutrófilo es inferior a 24 h, lo que limita la investigación básica sobre neutrófilos y la aplicación de estudios de neutrófilos. Nuestra investigación previa indicó que múltiples vías podrían mediar la muerte espontánea de los neutrófilos. Se desarrolló un cóctel dirigiéndose simultáneamente a estas vías, caspasas-permeabilización de membrana lisosomal-oxidante-necroptosis inhibición más factor estimulante de colonias de granulocitos (CLON-G), que prolongó la vida útil de los neutrófilos a más de 5 días sin comprometer significativamente la función de los neutrófilos. Al mismo tiempo, también se desarrolló un protocolo confiable y estable para evaluar y evaluar la muerte por neutrófilos. En este trabajo, mostramos que CLON-G puede prolongar la vida útil de los neutrófilos in vitro a más de 5 días, y exhibimos el alargamiento de la vida útil de los neutrófilos con FACS y microscopía de fluorescencia confocal. Este informe presenta procedimientos para la preparación de CLON-G y muestra un ensayo de muerte espontánea in vitro de neutrófilos, que puede utilizarse para el estudio de neutrófilos y para interrogar posteriormente la muerte de neutrófilos, proporcionando así un recurso confiable para la comunidad de neutrófilos.

La morfología teñida con Wright-Giemsa (Figura 2A-D) y los fenotipos FACS (Figura 2E-J) de los neutrófilos tratados con CLON-G no se vieron afectados. La viabilidad de los neutrófilos tratados con CLON-G a las 24 h fue de aproximadamente 90% + según el análisis de citometría de flujo (Figura 3) y los ensayos de imagen fluorescente (Figura...

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Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

Este protocolo detalla la preparación de CLON-G para extender la vida útil de los neutrófilos a más de 5 días y proporciona un procedimiento confiable para evaluar la muerte de neutrófilos con citometría de flujo y microscopía de fluorescencia confocal.

Extensión de la vida útil de los neutrófilos con CLON-G y un ensayo de muerte espontánea in vitro

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...

Nuestro protocolo proporciona un medio de cóctel para prolongar la vida útil de los neutrófilos a más de cinco días sin comprometer las funciones de los neutrófilos. También ofrece diálisis in vitro confiable para neutrófilos. El tratamiento con CLON-G amplía las posibilidades de preservación, transporte y manipulación de genes de neutrófilos, lo que puede acelerar la investigación en la comunidad de neutrófilos.Para comenzar, prepare el medio básico agregando RPMI 1640 FBS y pen-strep a un tubo de 50 mililitros. Simultáneamente, descongele todas las soluciones madre de los componentes CLON-G en hielo. Luego diluir HSP 70 y 200 microgramos por mililitro de G-CSF en el medio básico.Transfiera 976 microlitros de medio básico a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. A esto, agregue los componentes CLON-G para preparar un mililitro de medio 2x CLON-G como se describe en el manuscrito. A continuación, prepare el cultivo de neutrófilos suspendiendo los neutrófilos de ratón aislados en el medio básico.Añadir el medio CLON-G, seguido del medio básico a 24 placas bien no cultivadas en tejidos. Luego agregue 100 microlitros de la suspensión celular preparada y pipete suavemente de tres a cuatro veces. Incubar la placa de cultivo a 37 grados centígrados con un suministro de dióxido de carbono al 5%.Manchar los neutrófilos cultivados con citospín y analizarlos usando un microscopio óptico. Para el análisis de citometría de flujo, agregue un mililitro de medio celular al cultivo de células de neutrófilos cultivado durante la noche. Mezcle el medio de cultivo celular pipeteándolo suavemente de cinco a siete veces y transfiera 100 microlitros de esta mezcla a un tubo de citometría de flujo en los puntos de tiempo deseados.Simultáneamente, vortex las perlas de conteo y pipeta de 10 microlitros de solución de perlas al mismo tubo de citometría de flujo que contiene el medio celular. Agregue 10 microlitros de una mezcla de tinción preparada previamente a este tubo de citometría de flujo e incube durante cinco minutos en el refrigerador bajo la oscuridad. Luego agregue 100 microlitros de solución salina al tubo y mezcle bien para una distribución uniforme de las perlas y células de conteo.Finalmente, realizar el análisis de citometría de flujo de la suspensión celular como se describe en el texto manuscrito. Para el ensayo de imágenes fluorescentes, agregue dos mililitros de suspensión celular por placa confocal e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Mientras tanto, disuelva un gramo de cloruro de calcio en 45 mililitros de solución salina y fílelo con una unidad de filtrado de 0,2 micrómetros.Retire suavemente la placa confocal en el momento requerido. Tiñir las células con 10 microlitros de FITC-Annexin-V, PI y cloruro de calcio durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, usando un microscopio de fluorescencia confocal, capture las imágenes utilizando los canales deseados.En el presente estudio, la morfología de los neutrófilos no se vio afectada en el medio CLON-G incluso después de cinco días. Además, los fenotipos de fax demostraron células intactas después del tratamiento. El análisis de citometría de flujo mostró una población positiva de neutrófilos no tratados en la anexina-V y la pérdida de población podría deberse al ácido etilendiamina tetraacético en el medio celular.Sin embargo, la viabilidad de los neutrófilos tratados con CLON-G a las 24 horas fue de aproximadamente más del 90%. Los neutrófilos cultivados en el medio básico durante 24 horas mostraron células hinchadas y la pérdida de estas células podría haber resultado de la sacudida o pipeteo de la placa confocal. Las concentraciones y los efectos del compuesto CLON-G pueden afectar significativamente las pruebas de neutrófilos.Si es posible, evite modularlos. Las investigaciones de neutrófilos son laboriosas, costosas y extremadamente limitadas en su aplicación clínica debido a su corta vida útil. Este método supera parcialmente estos obstáculos.

Research

JoVE Journal

Biology

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