这是第一个允许将人类诱导的多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞的方案，具有良好的屏障特性，成熟的紧密连接，以及介导免疫细胞迁移到中枢新手系统的内皮细胞粘附分子的表达。EECM-BMEC样细胞允许以完全自体的方式研究免疫细胞跨血脑屏障的迁移，血脑屏障模型来自患者。将MS患者的人诱导多能干细胞分化为EECM-BMEC样细胞使我们能够识别MS患者的这些体外模型中的内在屏障缺陷。
因此，这种培养方法将使我们能够在未来识别这些受损屏障特性背后的分子途径。这些方法可以应用于更广泛的疾病，其中血清形态和免疫细胞浸润到CNS中对于这些发病机制至关重要，例如中风或神经感染。第一次尝试这种技术时，请使用相同数量的细胞材料。
种子密度是该协议成功的关键，需要根据所使用的克隆进行调整。演示该程序的将是我实验室的助理教授Kinya Matsuo。在内皮祖细胞培养的第5天，从孔中吸出培养基，并向每个孔中加入一毫升解离试剂。
将板在 37 摄氏度下孵育 6 到 8 分钟。使用微量移液器解离并单异化细胞。然后，将细胞悬液通过 40 微米细胞过滤器，过滤到含有 10 毫升 DMEM/F-12 10 培养基的 50 毫升管中。
要停止消化反应，请添加 DM DMEM/F-12 10 培养基至 50 毫升标记。彻底移液并保留10微升用于计数细胞。将 50 毫升管以 200 克在 20 至 25 摄氏度下离心五分钟以沉淀细胞。
离心后，除去上清液并用10毫升DMEM / F-12 10培养基重悬细胞沉淀。将细胞悬液转移到新鲜的15毫升管中。在20至25摄氏度下以200克离心5分钟，以再次沉淀细胞。
然后将细胞沉淀重悬到流动缓冲液一中。接下来，以 1：100 的比例加入 FCR 封闭试剂并孵育五分钟。然后加入一比200比例稀释的异硫氰酸荧光素或FITC标记的CD31抗体。
将悬浮液在黑暗中在20至25摄氏度的温度下孵育30分钟。在孵育结束时，向样品中加入10毫升流动缓冲液一，并保留10微升悬浮液用于流式细胞术分析以确定CD31阳性细胞的分数。将细胞在 20 至 20 摄氏度下以 200 g 离心五分钟。
离心后，用流动缓冲液一种溶液重悬细胞。接下来，每 100 微升细胞悬液加入 5 微升 FITC精选鸡尾酒。通过移液将溶液彻底混合，并在20至25摄氏度的温度下在黑暗中孵育15分钟。
接下来，每100微升细胞悬液添加5微升磁性纳米颗粒。将混合物移液充分，并在 20 至 25 摄氏度的黑暗中孵育 10 分钟。将细胞悬液转移到5毫升流式细胞术管中，并加入1个流动缓冲液，以获得2.5毫升的总体积。
然后将流式细胞术管放入磁铁中五分钟。在连续运动中，倒置磁铁并倒出含有FITC CD31抗体未标记细胞的细胞悬液。将磁铁和管子保持在倒置位置两到三秒钟，然后取出剩余的液体。
在将管子恢复到直立位置之前，吸出管子边缘的任何液滴。从磁铁中取出流式细胞术管，并加入2.5毫升流动缓冲液一以洗涤剩余的CD31阳性细胞。轻轻上下移液细胞两到三次以重悬。
然后将流管放入磁铁中五分钟。重复洗涤至少四次，以从试管中取出FITC CD31未标记的细胞。从磁铁上取管，并用所需量的合适培养基重悬纯化的CD31阳性细胞。
保留两个 10 微升等分试样的悬浮液，一个用于细胞计数，第二个用于进行流式细胞术分析，以评估磁后活化细胞分选样品中 CD31 阳性细胞的纯度。从含有内皮和非内皮细胞群的六个孔板中取出HECSR培养基。然后向每个孔中加入一毫升解离试剂。
在显微镜下仔细观察细胞形态。当内皮细胞看起来明亮而圆润时，通常在两到五分钟内，通过敲击板的边缘将它们分离。非内皮细胞仍然附着在板上。
使用微量移液器小心地收集分离的内皮细胞，而不会干扰非内皮细胞，并将它们转移到每毫升解离试剂中含有4毫升DMEM / F-12 10的15毫升或50毫升离心管中。然后将两毫升HECSR培养基加入含有剩余附着的非内皮细胞的孔中，以建立平滑肌样细胞或SMLC，并将板放入培养箱中。将内皮细胞悬液转移到离心管中。
充分混合并保留10微升悬浮液用于细胞计数。将剩余的细胞在 20 至 20 摄氏度下以 200 g 离心五分钟。然后加入两毫升HECSR培养基。
接下来，从先前制备的胶原蛋白编码的六孔板中取出溶液胶原蛋白，并向每个孔中加入两毫升内皮细胞悬液。然后，将板在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育。EECM-BMEC样细胞连接分子（包括claudin-5，occludin和VE-钙粘蛋白）的免疫荧光染色用于评估细胞形态以及连续和成熟连接的存在。
用促炎细胞因子（例如肿瘤坏死因子α和干扰素γ）刺激接种在腔室载玻片上的EECM-BMEC样细胞，这些细胞因子稀释在SMLC衍生的条件培养基中，上调了粘附分子（如ICAM-1和VCAM-1）的表达。此处显示了平滑肌细胞标志物（包括α平滑肌动蛋白，钙钙蛋白和平滑肌蛋白22 α）的代表性图像。用促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子α和干扰素γ）刺激EECM-BMEC样细胞上调了几种粘附分子（包括ICAM-1，VCAM-1和P-选择素）的细胞表面表达。
此外，炎性细胞因子的刺激也上调了内皮粘附分子的表达，并促进了粘附在EECM-BMEC样细胞单层上的免疫细胞数量的增加 EECM-BMEC样细胞也有望深入了解血脑屏障水平的病理生理机制，并作为开发血脑屏障稳定新治疗靶点的宝贵工具。
