Differensiering av humane induserte pluripotente stamceller til hjernens mikrovaskulære endotelcellelignende celler med en moden immunfenotype

Dette er den første protokollen som gjør det mulig å differensiere menneskeskapte pluripotente stamceller i hjernens mikrovaskulære endotelceller med gode barriereegenskaper, modne tette kryss og ekspresjon av endotelcelleadhesjonsmolekyler som medierer immuncellemigrasjon inn i det sentrale nybegynnersystemet. EECM-BMEC-lignende celler tillater å studere immuncellemigrasjon over blodhjernebarrieren med blodhjernebarrieremodeller avledet fra pasientene på en fullstendig autolog måte. Differensiering av menneskeskapte pluripotente stamceller fra MS-pasienter til EECM-BMEC-lignende celler har gitt oss mulighet til å identifisere inneboende barrieredefekter i disse in vitro-modellene av MS-pasientene.

Denne kulturelle metoden vil derfor tillate oss å identifisere de molekylære veiene som ligger til grunn for disse svekkede barriereegenskapene i fremtiden. Disse metodene kan anvendes på et bredere spekter av sykdommer der serummorfologi og immuncelleinfiltrasjon i CNS er kritisk for disse patogenesene, for eksempel hjerneslag eller nevroinfeksjon. Når du prøver denne teknikken for første gang, bruk samme mengde cellematerialer.

Såtettheten er nøkkelen til suksess for denne protokollen og må justeres avhengig av klonene som brukes. Demonstrere prosedyren vil være Kinya Matsuo, assisterende professor fra laboratoriet mitt. På dag fem av endotelial stamcelledyrking aspirerer mediet fra brønnene og tilsetter en milliliter dissosiasjonsreagens til hver brønn.

Inkuber platen i seks til åtte minutter ved 37 grader celsius. Ved hjelp av en mikropipette dissociere og singularisere cellene. Deretter passerer cellesuspensjonen gjennom en 40 mikrometer cellesil for å filtrere inn i et 50 milliliter rør som inneholder 10 ml DMEM / F-12 10 medium.

For å stoppe fordøyelsesreaksjonen, tilsett DM DMEM / F-12 10 medium opp til 50 millilitersmerket. Grundig pipette og reserver 10 mikroliter for å telle cellene. Sentrifuger 50 milliliters røret ved 200 g i fem minutter ved 20 til 25 grader celsius for å pelletere cellene.

Etter sentrifugering, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten med 10 ml DMEM / F-12 10 medium. Overfør cellesuspensjonen til et nytt 15 milliliter rør. Sentrifuge ved 200 g i fem minutter ved 20 til 25 grader celsius for å pelletere cellene igjen.

Deretter resuspenderer cellepelleten i strømningsbuffer en. Deretter tilsettes FCR-blokkeringsreagenset i forholdet ett til 100 og inkuberes i fem minutter. Deretter legger du til en til 200-forholdet fortynnet fluoresceinisotiocyanat eller FITC-merket CD31-antistoff.

Inkuber suspensjonen i 30 minutter i mørket ved en temperatur mellom 20 og 25 grader celsius. På slutten av inkubasjonen, tilsett 10 ml strømningsbuffer en til prøven og reserver 10 mikroliter av suspensjonen for flowcytometrianalyse for å bestemme fraksjonen av CD31-positive celler. Sentrifuge cellene ved 200 g i fem minutter ved 20 til 25 grader celsius.

Etter sentrifugering resuspenderes cellene med strømningsbuffer en løsning. Deretter tilsettes fem mikroliter av FITC-utvalgscocktailen per 100 mikroliter av cellesuspensjonen. Bland oppløsningen grundig ved pipettering og inkuber i mørket i 15 minutter ved en temperatur mellom 20 og 25 grader celsius.

Deretter legger du til fem mikroliter magnetiske nanopartikler per 100 mikroliter cellesuspensjon. Pipetter blandingen godt og inkuber i mørket i 10 minutter ved 20 til 25 grader celsius. Overfør cellesuspensjonen til et fem milliliters flowcytometrirør og legg til strømningsbuffer en for å få et totalt volum på 2,5 milliliter.

Plasser deretter flowcytometrirøret i magneten i fem minutter. I en kontinuerlig bevegelse, snu magneten og dekanter cellesuspensjonen som inneholder FITC CD31 antistoff umerkede celler. Hold magneten og røret i omvendt stilling i to til tre sekunder, og fjern deretter gjenværende væske.

Aspirer eventuelle dråper på rørkanten før du returnerer røret til oppreist stilling. Hent flowcytometrirøret fra magneten og tilsett 2,5 ml strømningsbuffer en for å vaske de resterende CD31-positive cellene. Pipetter cellene forsiktig opp og ned to eller tre ganger for å resuspendere dem.

Plasser deretter strømningsrøret i magneten i fem minutter. Gjenta vasken minst fire ganger for å fjerne FITC CD31 umerkede celler fra røret. Fjern strømningsrøret fra magneten og resuspender de rensede CD31 positive cellene med ønsket mengde av et egnet medium.

Reserver to 10 mikroliters alikoter av suspensjonen, en for celletelling og den andre for å utføre flowcytometrianalyse for å vurdere renheten av CD31-positive celler i postmagnetiske aktiverte cellesorteringsprøver. Fjern HECSR-mediet fra de seks brønnplatene som inneholder endotel- og ikke-endotelcellepopulasjoner. Deretter tilsettes en milliliter dissosiasjonsreagens til hver brønn.

Nøye observere cellemorfologien under et mikroskop. Når endotelcellene virker lyse og runde, vanligvis innen to til fem minutter, løsner du dem ved å banke på kanten av platen. De ikke-endotelceller forblir festet til platen.

Ved hjelp av en mikropipette, samle forsiktig de frittliggende endotelceller uten å forstyrre ikke-endotelceller og overfør dem til et 15 milliliter eller 50 milliliter sentrifugerør inneholdende fire milliliter DMEM / F-12 10 per milliliter dissosiasjonsreagens. Deretter tilsettes to milliliter HECSR-medium til brønnene som inneholder de gjenværende vedlagte ikke-endotelceller for å etablere glatt muskel som celler eller SMLC og plasser platen i inkubatoren. Overfør endotelcellesuspensjonen til et sentrifugerør.

Bland grundig og reserver 10 mikroliter av suspensjonen for celletelling. Sentrifuge de resterende cellene ved 200 g i fem minutter ved 20 til 25 grader celsius. Deretter tilsettes to milliliter HECSR-medium.

Fjern deretter kollagenet for oppløsning fra en tidligere tilberedt kollagenkodet seks brønnplate og tilsett to milliliter endotelcellesuspensjon til hver brønn. Deretter inkuberer platen ved 37 grader celsius i 5% karbondioksid. Immunfluorescerende farging av EECM-BMEC-lignende cellejunctionale molekyler i inkludert claudin-5, occludin og VE-cadherin ble brukt til å vurdere cellemorfologi og tilstedeværelse av kontinuerlige og modne veikryss.

Stimulering av de EECM-BMEC-lignende cellene sådd på kammerbilder med proinflammatoriske cytokiner som tumornekrosefaktor alfa og interferon gamma fortynnet i SMLC-avledet betinget medium oppregulert ekspresjonen av adhesjonsmolekyler som ICAM-1 og VCAM-1. Representative bilder av glatte muskelcellemarkører, inkludert alfa glatt muskelaktin, calponin og glatt muskelprotein 22 alfa er vist her. Stimulering av de EECM-BMEC-lignende cellene med proinflammatoriske cytokiner som tumornekrosefaktor alfa og interferon gamma oppregulerte celleoverflateekspresjonen av flere adhesjonsmolekyler, inkludert ICAM-1, VCAM-1 og P-selektin.

Videre oppregulerte stimulering med inflammatoriske cytokiner også ekspresjonen av endoteladhesjonsmolekyler og fremmet det økte antallet immunceller som festet seg til EECM-BMEC-lignende cellemonolag EECM-BMEC-lignende celler er lovende også for grundig forståelse av patofysiologiske mekanismer på blod-hjernebarrierenivå, og som et verdifullt verktøy for å utvikle nytt terapeutisk mål for blod-hjernebarrierestabilisering.