1.4K Views
•
09:03 min
•
May 19th, 2023
DOI :
May 19th, 2023
•0:04
Introduction
1:33
Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) to Purify CD31+ Endothelial Progenitor Cells (EPCs)
5:27
Selective Passage to Purify EECM‐BMEC‐Like Cells and SMLCs
7:07
Results: Immunofluorescence Staining, Flow Cytometry Analysis, and Immune Cell Adhesion
8:29
Conclusion
Transcript
Detta är det första protokollet som gör det möjligt att differentiera humaninducerade pluripotenta stamceller till mikrovaskulära endotelceller i hjärnan med goda barriäregenskaper, mogna snäva korsningar och uttryck av endotelcelladhesionsmolekyler som förmedlar immuncellsmigration till det centrala nybörjarsystemet. EECM-BMEC-liknande celler gör det möjligt att studera immuncellsmigration över blod-hjärnbarriären med blod-hjärnbarriärmodeller härledda från patienterna på ett helt autologt sätt. Differentiering av humaninducerade pluripotenta stamceller från MS-patienter till EECM-BMEC-liknande celler har gjort det möjligt för oss att identifiera inneboende barriärdefekter i dessa in vitro-modeller av MS-patienterna.
Denna odlingsmetod kommer därför att göra det möjligt för oss att identifiera de molekylära vägar som ligger bakom dessa försämrade barriäregenskaper i framtiden. Dessa metoder kan tillämpas på ett bredare spektrum av sjukdomar där i serummorfologi och immuncellsinfiltration i CNS är avgörande för dessa patogeneser, till exempel stroke eller neuroinfektion. När du försöker denna teknik för första gången, använd samma mängd cellmaterial.
Sådddensiteten är nyckeln till framgång för detta protokoll och måste justeras beroende på vilka kloner som används. Demonstrerar proceduren kommer att vara Kinya Matsuo, biträdande professor från mitt laboratorium. På dag fem av endotelprogenitorcellodlingen aspirerar mediet från brunnarna och tillsätter en milliliter dissociationsreagens till varje brunn.
Inkubera plattan i sex till åtta minuter vid 37 grader celsius. Med hjälp av en mikropipett dissociera och singularisera cellerna. För sedan cellsuspensionen genom en 40 mikrometer cellsil för att filtrera in i ett 50 ml rör innehållande 10 ml DMEM / F-12 10-medium.
För att stoppa matsmältningsreaktionen, tillsätt DM DMEM / F-12 10 medium upp till 50 milliliter-märket. Pipettera noggrant och reservera 10 mikroliter för att räkna cellerna. Centrifugera 50 ml röret vid 200 g i fem minuter vid 20 till 25 grader celsius för att pellet cellerna.
Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och suspendera cellpelleten igen med 10 ml DMEM/F-12 10 medium. Överför cellsuspensionen till ett nytt 15 ml rör. Centrifugera vid 200 g i fem minuter vid 20 till 25 grader celsius för att pellet cellerna igen.
Återsuspendera sedan cellpelleten till flödesbuffert en. Tillsätt sedan FCR-blockeringsreagenset i förhållandet ett till 100 och inkubera i fem minuter. Tillsätt sedan en till 200-förhållandet utspädd fluoresceinisotiocyanat eller FITC-märkt CD31-antikropp.
Inkubera suspensionen i 30 minuter i mörker vid en temperatur mellan 20 och 25 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen tillsätts 10 ml flödesbuffert en till provet och reservera 10 mikroliter suspension för flödescytometrianalys för att bestämma fraktionen av CD31-positiva celler. Centrifugera cellerna vid 200 g i fem minuter vid 20 till 25 grader celsius.
Efter centrifugering suspendera cellerna med flödesbuffert en lösning. Tillsätt sedan fem mikroliter av FITC-urvalscocktailen per 100 mikroliter av cellsuspensionen. Blanda lösningen noggrant genom pipettering och inkubera i mörker i 15 minuter vid en temperatur mellan 20 och 25 grader Celsius.
Tillsätt sedan fem mikroliter magnetiska nanopartiklar per 100 mikroliter cellsuspension. Pipettera blandningen väl och inkubera i mörkret i 10 minuter vid 20 till 25 grader celsius. Överför cellsuspensionen till ett fem milliliter flödescytometrirör och tillsätt flödesbuffert en för att få en total volym på 2,5 ml.
Placera sedan flödescytometriröret i magneten i fem minuter. I en kontinuerlig rörelse, invertera magneten och dekantera cellsuspensionen innehållande FITC CD31-antikropp omärkta celler. Håll magneten och röret i inverterat läge i två till tre sekunder och ta sedan bort den återstående vätskan.
Aspirera eventuella droppar på rörkanten innan du återför röret till upprätt läge. Hämta flödescytometriröret från magneten och tillsätt 2,5 ml flödesbuffert en för att tvätta de återstående CD31-positiva cellerna. Pipettera försiktigt cellerna upp och ner två eller tre gånger för att återsuspendera dem.
Placera sedan flödesröret i magneten i fem minuter. Upprepa tvätten minst fyra gånger för att ta bort de omärkta FITC CD31-cellerna från röret. Ta bort flödesröret från magneten och suspendera de renade CD31-positiva cellerna med önskad mängd av ett lämpligt medium.
Reservera två 10 mikroliter alikvoter av suspensionen, en för cellräkning och den andra för att utföra flödescytometrianalys för att bedöma renheten hos CD31-positiva celler i postmagnetiska aktiverade cellsorteringsprover. Ta bort HECSR-mediet från de sex brunnsplattorna som innehåller endotel- och icke-endotelcellpopulationer. Tillsätt sedan en milliliter dissociationsreagens till varje brunn.
Observera noggrant cellmorfologin under ett mikroskop. När endotelcellerna verkar ljusa och runda, vanligtvis inom två till fem minuter, lossa dem genom att knacka på plattans kant. De icke-endotelcellerna förblir fästa vid plattan.
Använd en mikropipett, samla försiktigt de fristående endotelcellerna utan att störa de icke-endotelcellerna och överför dem till ett 15 ml eller 50 milliliter centrifugrör innehållande fyra milliliter DMEM / F-12 10 per milliliter dissociationsreagens. Tillsätt sedan två milliliter HECSR-medium till brunnarna som innehåller de återstående bifogade icke-endotelcellerna för att etablera glattmuskelliknande celler eller SMLC och placera plattan i inkubatorn. Överför endotelcellssuspensionen till ett centrifugrör.
Blanda noggrant och reservera 10 mikroliter av suspensionen för cellräkning. Centrifugera de återstående cellerna vid 200 g i fem minuter vid 20 till 25 grader celsius. Tillsätt sedan två milliliter HECSR-medium.
Ta sedan bort kollagenet för lösning från en tidigare beredd kollagenkodad sexbrunnsplatta och tillsätt två milliliter endotelcellssuspension till varje brunn. Inkubera sedan plattan vid 37 grader celsius i 5% koldioxid. Immunofluorescerande färgning av EECM-BMEC-liknande cellkorsningsmolekyler i inklusive claudin-5, occludin och VE-cadherin användes för att bedöma cellmorfologi och närvaron av kontinuerliga och mogna korsningar.
Stimulering av EECM-BMEC-liknande celler sådda på kammarglas med proinflammatoriska cytokiner såsom tumörnekrosfaktor alfa och interferon gamma utspädd i SMLC-härledd konditionerat medium uppreglerade uttrycket av vidhäftningsmolekyler såsom ICAM-1 och VCAM-1. Representativa bilder av glatta muskelcellmarkörer inklusive alfa glatt muskelaktin, kalponin och glatt muskelprotein 22 alfa visas här. Stimulering av EECM-BMEC-liknande celler med proinflammatoriska cytokiner som tumörnekrosfaktor alfa och interferon gamma uppreglerade cellyteuttrycket av flera vidhäftningsmolekyler inklusive ICAM-1, VCAM-1 och P-selectin.
Vidare uppreglerade stimulering med inflammatoriska cytokiner också uttrycket av endoteladhesionsmolekyler och främjade det ökade antalet immunceller som vidhäftade EECM-BMEC-liknande cellmonolager EECM-BMEC-liknande celler lovar också för fördjupad förståelse av patofysiologiska mekanismer på blod-hjärnbarriärnivå och som ett värdefullt verktyg för att utveckla nytt terapeutiskt mål för stabilisering av blod-hjärnbarriären.
Här beskrivs ett protokoll, extended endothelial cell culture method (EECM), som möjliggör differentiering av pluripotenta stamceller till hjärnans mikrovaskulära endotelcellsliknande (BMEC)-liknande celler. Dessa celler visar uttryck av endotelcelladhesionsmolekyler och är därför en human blod-hjärnbarriärmodell lämplig för att studera immuncellsinteraktioner in vitro.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved