Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

يشكر المؤلفون بصدق البروفيسور سارة م. فورتشن على تفضله بمشاركة أسهم M. smegmatis mc2155. كما أنهم يعترفون ب Servier Medical Art (smart.servier.com) لتوفير بعض العناصر الأساسية للشكل 1. إنهم يعترفون بصدق بدعم بقية أعضاء المختبر لتعديلات المرضى أثناء الاستخدام الطويل لهزازات الحاضنة وأجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي الفائقة لتخصيب mEV. كما أنهم يعترفون بالسيد سورجيت ياداف ، مساعد المختبر ، للتأكد دائما من أن الأواني الزجاجية والمواد الاستهلاكية اللازمة كانت دائما متاحة وسهلة الاستخدام. أخيرا ، يعترفون بالفرق الإدارية والمشتريات والمالية في THSTI لدعمهم المستمر ومساعدتهم في التنفيذ السلس للمشروع.

1. ظروف نمو المتفطرة السميغماتية ، الإشريكية القولونية ، ومشتقاتها
<ol><li>وسائط<ol><li>ميدلبروك 7H9 مرق السائل<ol><li>قم بإعداد محلول مخزون Tween-80 بنسبة 20٪ عن طريق التسخين المسبق للحجم المطلوب من الماء المقطر المزدوج (ddw) في دورق زجاجي إلى ~ 45-50 درجة مئويةفي ...

نظرا لأن تطوير لقاح جديد للسل يتفوق على BCG ويمكن أن يحل محله لا يزال يمثل تحديا هائلا ، كبديل ، تسعى العديد من المجموعات إلى اكتشاف لقاحات السل الفرعية المختلفة التي يمكن أن تعزز فعالية BCG وتطيل مدة الحماية48,49. نظرا للاهتمام المتزايد بالمركبات الكهربائية الب...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

على الرغم من تطوير وإدارة مجموعة واسعة من اللقاحات ضد الأمراض المعدية ، حتى يومنا هذا ، ~ 30 ٪ من جميع الوفيات البشرية لا تزال تحدث من الأمراض المعدية1. قبل ظهور لقاح السل (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - كان السل هو القاتل الأول (~ 10000 إلى 15000 / 100000 نسمة) 2. مع إعطاء BCG وسهولة الوصول إلى أدوية الخط الأول والثاني المضادة للسل ، بحلول عام 2022 ، انخفضت الوفيات المرتبطة بالسل بشكل كبير إلى ~ 1 مليون / سنة بحلول عام 2022 (أي ~ 15-20 / 100000 نسمة1). ومع ذلك ، في السكان الموبوءين بالسل في العالم ، لا تزال الوفيات المرتبطة بالسل تقف عند ~ 100-550 / 100000 نسمة1. بينما يدرك الخبراء عدة أسباب تؤدي إلى هذه الأرقام المنحرفة ، يبدو أن الحماية بوساطة BCG التي لا تدوم حتى في العقد الأول من العمر هي السبب البارز3،4،5،6،7. ونتيجة لذلك، وبالنظر إلى "أهداف التنمية المستدامة" المتجددة للأمم المتحدة و"استراتيجية القضاء على السل" لمنظمة الصحة العالمية، هناك جهد عالمي متضافر لتطوير بديل لقاح أفضل بكثير من لقاح بوسطن كونسلتينج جروب الذي ربما يوفر حماية مدى الحياة من السل.

ولتحقيق هذا الهدف، تقوم عدة مجموعات حاليا بتقييم سلالات BCG المعدلة/المؤتلفة، والأنواع الفطرية غير المسببة للأمراض والموهنة بخلاف BCG، والوحدات الفرعية المرشحة8،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18. عادة ما تكون لقاحات الوحدات الفرعية عبارة عن جسيمات شحمية محملة بشكل انتقائي بعدد قليل من البروتينات المناعية النقية (~ 1-6) كاملة الطول أو مبتورة من العامل الممرض. ومع ذلك ، بسبب طيها الزائف إلى توافقات غير أصلية و / أو تفاعلات عشوائية غير وظيفية بين البروتينات المحملة ، غالبا ما تفتقر الوحدات الفرعية إلى الحلقات الأصلية والوثيقة ، وبالتالي تفشل في تجهيز جهاز المناعة بشكل كاف14،19،20.

وبالتالي ، اكتسبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) للبكتيريا وتيرة كبديل واعد21،22،23،24،25،26. عادة ، تحتوي EVs البكتيرية (bEVs) على مجموعة فرعية من مكوناتها الخلوية ، بما في ذلك بعض أجزاء الأحماض النووية والدهون ومئات المستقلبات والبروتينات27,28. على عكس الجسيمات الشحمية حيث يتم تحميل عدد قليل من البروتينات النقية بشكل مصطنع ، تحتوي bEVs على مئات البروتينات المحملة بشكل طبيعي والمطوية محليا مع ميل أفضل لتجهيز جهاز المناعة ، خاصة بدون تعزيز / مساعدة المواد المساعدة ومستقبلات تشبه الرسوم (TLR)27،28،29. في هذا الخط من البحث ، استكشفنا نحن وآخرون فائدة المركبات الكهربائية المتفطرة كمعززات محتملة للوحدات الفرعية ل BCG30. على الرغم من المخاوف من أن المركبات الكهربائية تفتقر إلى أحمال مستضدات موحدة ، فقد نجحت المركبات الكهربائية من النيسرية السحائية الموهنة في حماية البشر من المكورات السحائية من المجموعة المصليةB 31,32.
من الناحية النظرية على الأقل ، فإن أفضل المركبات الكهربائية التي يمكن أن تعزز BCG بشكل جيد هي المركبات الكهربائية المخصبة من البكتيريا المسببة للأمراض. ومع ذلك ، فإن إثراء المركبات الكهربائية الناتجة عن المتفطرة المسببة للأمراض مكلف ويستغرق وقتا طويلا ومحفوفا بالمخاطر. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون المركبات الكهربائية الناتجة عن مسببات الأمراض أكثر ضراوة من الحماية. بالنظر إلى المخاطر المحتملة ، هنا ، نبلغ عن بروتوكول تم اختباره جيدا لتخصيب المركبات الكهربائية الناتجة عن MSM المزروعة محوريا ، وهي متفطرة طيرية الطيور.
ومع ذلك ، على الرغم من تشفير العديد من تقويم البروتين الممرض ، تفتقر المتفطرات الفيروسية إلى العديد من مستضدات اللقاح / حوامل البروتين المسببة للأمراض اللازمة لتجهيز الجهاز المناعي بشكل كاف نحو الحماية33. لذلك ، استكشفنا أيضا بناء وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM من خلال الهندسة الجزيئية ، بحيث يجب أن يصل جزء كبير من أي بروتين ممرض مهم يتم التعبير عنه وترجمته في MSM ، إلى EVs. افترضنا أن واحدا أو أكثر من أفضل 10 بروتينات وفيرة من MSM EVs عند دمجها مع البروتين محل الاهتمام سيساعد في هذا النقل.
بينما بدأنا في توحيد إثراء المركبات الكهربائية المتفطرة (mEVs) في مختبرنا ، في عام 2011 ، أبلغ Prados-Rosales et al. لأول مرة عن تصور وإثراء mEVs في المختبر30. في وقت لاحق ، في عام 2014 ، نشرت نفس المجموعة نسخة معدلة من طريقة2011 34. في عام 2015 ، أبلغ Lee et al. أيضا عن طريقة موحدة بشكل مستقل لتخصيب mEV مرة أخرى من الثقافات المحورية للمتفطرات35. من خلال الجمع بين كلا البروتوكولين 34,35 ودمج بعض تعديلاتنا بعد التوحيد الشامل ، نصف هنا بروتوكولا يساعد بشكل روتيني على إثراء mEVs من الثقافات المحورية للبكتيرياالفطرية 36.
هنا ، نفصل بشكل خاص إثراء المركبات الكهربائية الخاصة ب MSM ، وهو امتداد للبروتوكولالمنشور 36 لإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة بشكل عام. نحن أيضا بالتفصيل كيفية بناء mEVs المؤتلف (R-mEVs) التي تحتوي على بروتين mCherry (كمراسل فلوري أحمر) و EsxA (Esat-6) 37،38،39 وهو مناعي سائد ووحدة فرعية محتملة لقاح المتفطرة السلية. يظل بروتوكول إثراء R-mEVs مطابقا للبروتوكول الذي وصفناه لإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

معظم البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرات ، تولد حويصلات خارج الخلية (EVs). نظرا لأن EVs البكتيرية (bEVs) تحتوي على مجموعة فرعية من المكونات الخلوية ، بما في ذلك المستقلبات والدهون والبروتينات والأحماض النووية ، فقد قامت عدة مجموعات بتقييم الإصدارات الأصلية أو المؤتلفة من bEVs لقوتها الوقائية كمرشحين للقاح الوحدة الفرعية. على عكس المركبات الكهربائية الأصلية ، يتم تصميم المركبات الكهربائية المؤتلفة جزيئيا لتحتوي على واحد أو أكثر من مناعيات الاهتمام. على مدى العقد الماضي ، استكشفت مجموعات مختلفة مناهج متنوعة لتوليد المركبات الكهربائية المؤتلفة. ومع ذلك ، هنا ، نبلغ عن تصميم وبناء وإثراء المركبات الكهربائية المتفطرة المؤتلفة (mEVs) في المتفطرات. نحو ذلك ، نستخدم المتفطرة smegmatis (MSM) ، وهي متفطرة التربة الطيرية كنظام نموذجي. نصف أولا توليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية ل MSM. بعد ذلك ، نصف تصميم وبناء mEVs المؤتلف التي تحتوي إما على mCherry ، وهو بروتين مراسل فلوري أحمر ، أو EsxA (Esat-6) ، وهو مناعي بارز للمتفطرة السلية. نحقق ذلك عن طريق دمج mCherry و EsxA N-termini بشكل منفصل مع الطرف C لبروتين MSM صغير Cfp-29. Cfp-29 هو واحد من البروتينات القليلة الموجودة بكثرة من MsmEVs. يظل بروتوكول توليد وإثراء المركبات الكهربائية المؤتلفة من MSM مطابقا لتوليد وإثراء المركبات الكهربائية الأصلية من MSM.

نستخدم M. smegmatis (Msm) كنموذج المتفطرة لإثبات إثراء كل من mEVs الأصلية والمؤتلفة (R-mEVs). يعمل بروتوكول إثراء mEVs الملخص تخطيطيا (الشكل 1) أيضا على إثراء R-mEVs من MSM والمركبات الكهربائية الأصلية ل Mtb (مع تعديلات طفيفة كما في ملاحظات البروتوكول 1.2). يتطلب تصور mEVs المخصب تلطيخها سلبا تح...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

يفصل هذا البروتوكول إثراء الحويصلات خارج الخلية المتفطرة الأصلية (mEVs) من الثقافات المحورية للمتفطرة smegmatis (Msm) وكيف يمكن تصميم وإثراء mCherry (مراسل الفلورسنت الأحمر) المحتوي على MSMEVs المؤتلفة. أخيرا ، يتحقق من النهج الجديد مع إثراء MsmEVs التي تحتوي على بروتين EsxA من المتفطرة السلية.

إثراء الحويصلات خارج الخلية الأصلية والمؤتلفة من المتفطرات

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

يساعد إثراء المركبات الكهربائية المتفطرة في تحديد محتوياتها ، وفك رموز فصائلها ، وتواريخها في تصميم طرق لبناء وتوليد المركبات الكهربائية المؤتلفة التي تستغل بشكل أساسي اللقاحات المرشحة. ست سلاسل تولد من مواقع مختلفة من سطح البكتيريا. ليس لديهم علامات محفوظة.وبالتالي ، فإن أي نهج قائم على التقارب يمكن أن يثري فقط مجموعة فرعية من المركبات الكهربائية. في المقابل ، تلتقط طريقتنا جميع المتفطرات الكهربائية المتولدة. سيوضح الإجراء محمد إلياس ، طالب دكتوراه من مختبري.للبدء ، أضف ملليلتر واحد من مخزون الجلسرين من النوع البري أو المتفتلف المتفطرة smegmatis إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من مرق 7H9 المسخن مسبقا. أغلق الغطاء وقم بتدوير الأنبوب قبل احتضان المزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية بين 200 إلى 220 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، عندما تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى واحد تقريبا ، قم بطرد مركزي للثقافة عند 3،200 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية في حاوية سائلة.أضف ملليلترا واحدا من وسائط Sautons التي تم تسخينها مسبقا وأعد تعليقها برفق للحصول على تعليق موحد. قم بتكوين الحجم إلى 10 ملليلتر باستخدام وسائط Sautons. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى وتجاهل الطاف.بعد الغسيل ، أعد تعليق الخلايا البكتيرية. في 20 ملليلتر من وسائط Sautons الدافئة مسبقا وقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. قم بتلقيح الحجم المطلوب من المعلق البكتيري في دورق Erlenmeyer بسعة لتر إلى لترين يحتوي على 330 ملليلتر من وسائط Sautons واحتضانه عند 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة الضوئية إلى 0.3.في اليوم التالي ، اغسل الخلايا مرة واحدة كما هو موضح سابقا وأعد تعليق الحبيبات في 330 ملليلتر من Sautons تحتوي على 1/10 Tween 80. وزع 50 ملليلترا من معلق الخلية في ست قوارير سعة لتر واحد ، تحتوي كل منها على 280 ملليلترا من Sautons قبل التسخين تحتوي على 1/10 Tween 80. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية في 200 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة البصرية إلى 2.5.أضف لترين من مزارع المرحلة الأسية المتوسطة إلى ست زجاجات سعة 400 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 8،000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع القوارير أو الأكواب الطافية والمبردة مسبقا وقم بتخزين حصة من الحبيبات للإجراءات التحليلية. يتم تلوين الحبيبات إذا كانت المركبات الكهربائية مؤتلفة ل mCherry وبنية اللون إذا كانت من النوع البري أو المؤتلف للبروتينات غير الفلورية.قم بتصفية طاف الاستزراع من خلال مرشح التخلص 0.45 ميكرون ، متبوعا بالترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرون لإزالة جميع آثار البكتيريا. بعد ذلك ، اغسل مسبقا مكثفات الغشاء 30 كيلو دالتون ب 15 مل من الماء المقطر المزدوج عند 4،000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل ب 15 مل من وسائط Sautons الباردة المفلترة مسبقا باستخدام نفس الظروف لإزالة جميع آثار المواد الكيميائية.بعد الغسيل ، أضف 15 مل من المادة الطافية المستزرعة المفلترة إلى مكثف وركز عند 4،000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل المركز إلى أنبوب طرد مركزي بارد من طراز أوك ريدج سعة 40 ملليلتر أو أنبوب طرد مركزي جديد من طراز فالكون سعة 50 ملليلتر. بمجرد تركيز لترين كاملين من ترشيح المزرعة ، انقل المركز إلى أنبوب طرد مركزي مزدوج مقطر ومغسول ومبرد مسبقا سعة 50 ملليلتر من مادة البولي بروبيلين ويخضع للطرد المركزي من خطوتين.أولا عند 4،000 جيجا ، ثم عند 15،000 G.نقل تركيز الطرد المركزي إلى أنبوب طرد مركزي فائق التبريد مسبقا 38.5 ملليلتر وتدور عند 100،000 G لمدة أربع ساعات عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي جديد من طراز فالكون سعة 50 ملليلتر مبرد مسبقا. اقلب أنبوب الطرد المركزي الفائق على ورق ماص جديد خال من النسالة لإزالة آثار المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت HEPES.ضع طبقة من الحبيبات المعاد تعليقها في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي UltraClear UltraClear المبرد مسبقا سعة 13 ملليلتر واخلطه برفق مع أربعة ملليلتر من محلول اليوديكسانول المتدرج الخامل بكثافة 60٪. ثم تراكب مع ملليلتر واحد لكل من 40٪ 30٪ 20٪ و 10٪ من اليوديكسانول. املأ الأنبوب بإضافة أربعة ملليلتر من 6٪ يوديكسانول في الأعلى.بعد وزن الأنبوب بعناية في دورق زجاجي أو حامل ، انقله برفق إلى الدلاء المتأرجحة ثم إلى دوار الدلاء المتأرجحة للطرد المركزي الفائق عند 141،000 جم لمدة 16 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي الفائق ، قم بإزالة الأنبوب بعناية وجمع جزء واحد ملليلتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقم. أظهر تحليل TEM أن المركبات الكهربائية المتفطرة دائرية وتتبع نانو أكد تحليل EVs مختلفة الأحجام بأقطار تتراوح بين 20 و 250 نانومتر.عندما تم دمج الطرف N من mCherry بشكل متعدي مع الطرف C من CFP-29 ، تحول جزء من mEVs المخصب من MSM إلى اللون الوردي ، مما يشير إلى قدرة cf-29 على حمل بروتين غريب مهم. ثم تم استخدام CFP-29 لتقييم تسليم EsxA إلى MSM EVs. لوحظ Mtb's EsxA في MSM EVs بكميات منخفضة.كان CFP-29 EsxA 3X FLAG أكثر استقرارا وتراكم عند مستويات أعلى في mEVs. يوفر إثراء المركبات الكهربائية من المتفطرات التي تزرع في ظل ظروف فسيولوجية مختلفة نظرة ثاقبة لمحتوياتها المتغيرة ووظائفها المعدلة التي تملي العدوى المستمرة والتسبب في المرض وانتشار مسببات الأمراض.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

المؤتلف إنتاج فيروسات الرجعية والعدوى من خلايا B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

إنتاج وناقلات Titering الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسية

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

الببتيد: MHC Tetramer القائم على إثراء خلايا T حاتمة محددة

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

التصور من الفحم آجار ريسازورين الفحص لشبه الكمي، متوسطة الإنتاجية تعداد مايكوباكتيريا

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...