Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
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作者衷心感谢 Sarah M. Fortune 教授慷慨分享 耻垢分 枝杆菌mc 2155 股票。他们还感谢施维雅医学艺术 （smart.servier.com） 为 图 1 提供了一些基本元素。他们衷心感谢实验室其他成员在长期使用培养箱振荡器、离心机和超速离心机进行 mEV 富集期间对患者调整的支持。他们还感谢实验室助理 Surjeet Yadav 先生始终确保必要的玻璃器皿和耗材始终可用且方便。最后，他们感谢 THSTI 的行政、采购和财务团队在项目无缝执行方面的持续支持和帮助。

1. 耻垢分枝杆菌、 大肠杆菌及其衍生物的生长条件
<ol><li>媒体<ol><li>Middlebrook 7H9 液体肉汤<ol><li>通过在微波炉中将玻璃烧杯中所需体积的双蒸水 （ddw） 预热至 ~45-50 oC 来制备 20% 吐温-80 储备溶液，使用适当的量筒加入所需体积的吐温-80，并在小型磁力搅拌器上连续搅拌，使 20% 吐温-80 进入均匀溶液。通过0.22um处置过滤器过滤20%吐温-80?...

由于开发一种优于并可以替代卡介苗的新型结核病疫苗仍然是一个艰巨的挑战，作为一种替代方案，一些小组正在寻求发现不同的亚单位结核病疫苗，这些疫苗可以提高卡介苗的效力并延长其保护期48,49。鉴于细菌 EV （bEV） 作为潜在亚基和天然佐剂50,51 越来越受到关注，持续富集足够数量的 mEV 用于其下游测...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

尽管开发和管理了针对传染病的各种疫苗，但直到今天，~30% 的人类死亡仍然发生在传染病1.在结核病 （TB） 疫苗 - 卡介苗 （BCG） 出现之前，结核病是头号杀手（~10,000 至 15,000/100,000 人口）2。随着卡介苗的实施以及一线和二线抗结核药物的易得性，到 2022 年，结核病相关死亡人数已大幅下降到 ~100 万/年（即 ~15-20/100,000 人口1）。然而，在世界结核病流行人群中，结核病相关死亡人数仍为~100-550/100,000人口1。虽然专家们认识到导致这些数字出现偏差的几个原因，但卡介苗介导的保护甚至不会持续到生命的头十年，这似乎是突出的原因3,4,5,6,7。因此，鉴于联合国更新的“可持续发展目标”和世卫组织的“终结结核病战略”，全球正在共同努力开发一种比卡介苗更优越的疫苗替代品，这种疫苗可能提供终生预防结核病的保护。

为了实现这一目标，几个小组目前正在评估改良/重组卡介苗菌株、除卡介苗以外的非致病性和减毒分枝杆菌物种以及候选亚基8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18.通常，亚单位疫苗是脂质体，选择性地装载了少量纯化 （~1-6） 病原体的全长或截短的免疫原性蛋白。然而，由于它们虚假地折叠成非天然构象和/或负载蛋白质之间的随机非功能性相互作用，亚基通常缺乏天然和密切相关的表位，因此无法充分启动免疫系统14,19,20。

因此，细菌的细胞外囊泡 （EV） 作为有前途的替代品 21,22,23,24,25,26 已经加快了步伐。通常，细菌 EV （bEV） 包含其细胞成分的一个子集，包括核酸、脂质和数百种代谢物和蛋白质的某些部分27,28。与人工加载一些纯化蛋白质的脂质体不同，bEV 包含数百种自然加载的天然折叠蛋白质，具有更好的启动免疫系统的倾向，尤其是在没有佐剂和 Toll 样受体 （TLR） 激动剂的增强/帮助的情况下27,28,29。正是在这项研究中，我们和其他人探索了分枝杆菌 EV 作为 BCG30 潜在亚基增强剂的效用。尽管人们担心 bEV 缺乏均匀的抗原载量，但来自减毒脑膜炎奈瑟菌的 EV 已成功保护人类免受血清群 B 脑膜炎球菌的侵害31,32。
至少从理论上讲，能够很好地促进卡介苗的最佳电动汽车是从病原菌中富集的电动汽车。然而，富集致病分枝杆菌产生的 EV 是昂贵、耗时且有风险的。此外，病原体产生的 EV 可能毒性大于保护性。鉴于潜在风险，在这里，我们报告了一种经过充分测试的方案，用于富集由轴向生长的 Msm（一种无毒分枝杆菌）产生的 EV。
然而，尽管编码了几种病原体蛋白直系同源物，但无毒分枝杆菌缺乏几种疫苗抗原/致病蛋白表位，这些抗原/致病蛋白表位是充分启动免疫系统以提供保护所必需的33。因此，我们还探索了通过分子工程构建和富集 Msm 的重组 EV，使得在 Msm 中表达和翻译的任何目标致病蛋白的很大一部分必须到达其 EV。我们假设，当与感兴趣的蛋白质融合时，Msm EVs 的前 10 种丰度蛋白质中的一种或多种将有助于这种易位。
当我们开始在实验室中标准化分枝杆菌 EV （mEV） 的富集时，2011 年，Prados-Rosales 等人首次报道了 mEV 在体外30 的可视化和富集。后来，在 2014 年，同一小组发布了他们 2011 年方法34 的修改版本。2015 年，Lee 等人还报道了一种独立的标准化方法，用于再次从分枝杆菌 35 的 axenic 培养物中富集mEV。结合两种方案 34,35 并在彻底标准化后合并我们的一些修改，我们在这里描述了一种方案，该方案有助于从分枝杆菌36 的 axenic 培养物中常规富集 mEV。
在这里，我们特别详细介绍了 Msm 特异性 EV 的富集，这是已发表的方案36 的扩展，用于富集分枝杆菌 EV。我们还详细介绍了如何构建含有 mCherry 蛋白（作为红色荧光报告基因）和 EsxA （Esat-6）37,38,39 的重组 mEV （R-mEV），这是一种主要免疫原和结核分枝杆菌的潜在亚基疫苗原。富集 R-mEV 的协议与我们描述的从 Msm 富集天然 EV 的协议相同。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

大多数细菌，包括分枝杆菌，都会产生细胞外囊泡 （EV）。由于细菌 EV （bEV） 包含细胞成分的子集，包括代谢物、脂质、蛋白质和核酸，因此一些小组已经评估了 bEV 的天然或重组版本作为亚单位候选疫苗的保护效力。与天然 EV 不同，重组 EV 经过分子工程改造，含有一种或多种感兴趣的免疫原。在过去十年中，不同的团队探索了生成重组bEV的不同方法。然而，在这里，我们报告了分枝杆菌中重组分枝杆菌 EV （mEV） 的设计、构建和富集。为此，我们使用 耻垢分枝 杆菌（Msm），一种无毒的土壤分枝杆菌作为模型系统。我们首先描述了 Msm 原生 EV 的产生和丰富。然后，我们描述了重组 mEV 的设计和构建，这些重组 mEV 含有 mCherry（一种红色荧光报告蛋白）或 EsxA （Esat-6）（一种突出的 结核分枝杆菌免疫原）。我们通过将 mCherry 和 EsxA N 端分别与小 Msm 蛋白 Cfp-29 的 C 端融合来实现这一点。 Cfp-29 是为数不多的大量存在的 MsmEV 蛋白之一。从 Msm 生成和富集重组 mEV 的协议与生成和富集 Msm 的天然 EV 的协议相同。

我们使用 耻垢分枝杆 菌 （Msm） 作为模型分枝杆菌来证明天然和重组 mEV （R-mEV） 的富集。这种示意性总结的 mEVs 富集方案（图 1）也适用于 Msm 的 R-mEV 和 Mtb 的天然 EV 的富集（稍作修改，如 1.2 的方案说明）。富集的mEV的可视化需要在透射电子显微镜下对它们进行负染色36 （图2A）。通常，Msm 特异性 EV 在 13 mL 6-60% 密度梯度的<...

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Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

该方案详细介绍了从耻垢分枝杆菌（Msm）的无轴培养物中富集天然分枝杆菌细胞外囊泡（mEV），以及如何设计和富集含有mCherry（红色荧光报告基因）的重组MsmEV。最后，通过富集含有结核分枝杆菌EsxA蛋白的MsmEVs验证了新方法。

富集分枝杆菌的天然和重组细胞外囊泡

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

富集分枝杆菌 EV 有助于描述其内容、破译其派系和日期，设计构建和生成主要利用候选疫苗的重组 EV 的方法。六个系列从细菌表面的不同位置产生。它们没有保守的标记。因此，任何基于亲和力的方法都只能丰富 EV 的子集。相比之下，我们的方法捕获了所有生成的分枝杆菌EV。演示该程序的将是来自我实验室的博士生Mohd Ilyas。首先，将一毫升野生型或重组耻垢分枝杆菌的甘油原液加入含有 10 毫升预热 7H9 肉汤的 50 毫升离心管中。盖上盖子并旋转试管，然后在 37 摄氏度下以 200 至 220 RPM 的转速孵育培养物过夜。第二天，当600纳米的光密度达到大约1时，在室温下以3,200g离心培养物10分钟，并将上清液丢弃到液体丢弃容器中。加入一毫升预热的 Sautons 培养基，轻轻重悬以获得均匀的悬浮液。使用 Sautons 培养基将体积补足至 10 毫升。再次离心并弃去上清液。洗涤后，重悬细菌细胞。在 20 毫升预热的 Sautons 介质中，并测量 600 纳米的光密度。将所需体积的细菌悬浮液接种到含有 330 毫升 Sautons 培养基的一至两升锥形瓶中，并在 37 摄氏度下以 200 RPM 孵育，直到光密度达到 0.3。第二天，如前所述洗涤细胞一次，并将沉淀重悬于含有 1/10 吐温 80 的 330 毫升 Sautons 中。将 50 毫升细胞悬液分配到六个一升烧瓶中，每个烧瓶含有 280 毫升预热的 Sautons，其中含有 1/10 吐温 80。将培养物在 37 摄氏度下以 200 RPM 孵育，直到光密度达到 2 至 2.5。将两升中指数阶段培养物加入六个 400 毫升瓶中，并在 4 摄氏度下以 8， 000 G 离心 20 分钟。收集上清液和预冷的高压灭菌烧瓶或烧杯，并储存沉淀的等分试样用于分析程序。如果 EV 是 mCherry 的重组体，则颗粒是彩色的，如果它们是野生型的或非荧光蛋白的重组体，则为棕色。通过0.45微米的处理过滤器过滤培养上清液，然后通过0.22微米的过滤器过滤以除去所有细菌痕迹。接下来，用 15 毫升 4， 000 G 的双蒸水在 4 摄氏度下预洗 30 千道尔顿的膜浓缩器 20 分钟。然后用 15 毫升预过滤的冷 Sautons 介质使用相同的条件洗涤，以去除所有微量的化学物质。洗涤后，将15毫升过滤的培养上清液加入浓缩器中，并在4°C下以4， 000 G浓缩20分钟。将浓缩液转移到冷的 40 毫升 Oak Ridge 离心管或 50 毫升新鲜的 Falcon 离心管中。一旦整个两升培养滤液浓缩，将浓缩液转移到双重蒸馏、洗涤和预冷的 50 毫升聚丙烯离心管中，并进行两步离心。首先在4,000 G，然后在15， 000 G.将离心浓缩物转移到预冷的38.5毫升超速离心管中，并在4摄氏度下以100,000 G旋转四个小时。将上清液收集在预冷的 50 毫升新鲜 Falcon 离心管中。将超速离心管倒置在新鲜的无绒吸收纸上，以去除微量上清液，并将沉淀重悬于600微升HEPES缓冲液中。将重悬的沉淀分层在 13 毫升预冷的 UltraClear 聚丙烯超速离心管的底部，并与 4 毫升惰性 60% 密度梯度碘克沙醇溶液轻轻混合。然后用40%30%20%和10%碘克沙醇各覆盖一毫升。通过在顶部加入四毫升 6% 碘克沙醇来填充试管。在玻璃烧杯或支架中仔细称量试管后，轻轻地将其转移到摆动桶中，然后转移到摆动桶转子中，在四摄氏度下以 141， 000 G 超速离心 16 小时。超速离心后，小心地取出试管并将一毫升馏分收集到高压灭菌的微量离心管中。透射电镜分析表明分枝杆菌EV是圆形的，纳米跟踪分析证实了直径在20至250纳米之间不同尺寸的EV。当 mCherry 的 N 端平移融合到 CFP-29 的 C 端时，Msm 的一部分富集 mEV 变成粉红色，表明 cf-29 能够携带感兴趣的外源蛋白。然后使用 CFP-29 评估 EsxA 向 Msm EV 的交付。在 Msm EV 中观察到 Mtb 的 EsxA 数量很少。CFP-29 EsxA 3X FLAGs更稳定，在mEVs中积累的水平更高。从生理不同条件下生长的分枝杆菌中富集 EV 可以深入了解其改变的内容和修饰的功能，这些功能决定了持续的感染性、发病机制和病原体传播。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

质粒DNA重组流感病毒的一代

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

科研

免疫与感染

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

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The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

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重组腺相关病毒载体的生产和滴定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

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从救援的cDNA重组新城疫病毒

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流量Virometry来分析病毒颗粒的抗原谱和外囊泡

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

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Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

成年日本血吸虫细胞外囊泡的分离与鉴定

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

利用超滤离心技术分离小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

重组呼吸道合胞病毒的生成、扩增和滴定

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...