Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Forfatterne takker oprigtigt professor Sarah M. Fortune for venligt at dele M. smegmatis mc2155 lager. De anerkender også Servier Medical Art (smart.servier.com) for at give nogle grundlæggende elementer til figur 1. De anerkender oprigtigt støtten fra resten af laboratoriemedlemmerne til deres patientjusteringer under den lange brug af inkubatorrystere, centrifuger og ultracentrifuger til mEV-berigelse. De anerkender også Mr. Surjeet Yadav, laboratorieassistenten, for altid at sikre, at de nødvendige glasvarer og forbrugsvarer altid var tilgængelige og praktiske. Endelig anerkender de THSTI's administrative, indkøbs- og økonomiteams for deres konstante støtte og hjælp til problemfri udførelse af projektet.

1. Vækstbetingelser for Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli og derivater heraf
<ol><li>Medie<ol><li>Middlebrook 7H9 flydende bouillon<ol><li>Forbered 20% Tween-80 stamopløsning ved at forvarme det krævede volumen dobbeltdestilleret vand (ddw) i et glasbægerglas til ~ 45-50 oC i en mikrobølgeovn, tilsæt det krævede volumen Tween-80 ved hjælp af en passende målecylinder, og rør kontinuerligt på en lille magnetisk omrører for...

Da udvikling af en ny TB-vaccine, der er bedre end og kan erstatte BCG, fortsat er en formidabel udfordring, forfølger flere grupper som et alternativ opdagelsen af forskellige underenhed TB-vacciner, der kan øge BCGs styrke og forlænge dens beskyttende varighed48,49. I betragtning af den stigende opmærksomhed på bakterielle EV'er (bEV'er) som potentielle underenheder og som naturlige hjælpestoffer50,51</...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

På trods af udvikling og administration af en bred vifte af vacciner mod infektionssygdomme, selv den dag i dag, forekommer ~ 30% af alle menneskelige dødsfald stadig fra smitsomme sygdomme1. Før fremkomsten af tuberkulosevaccinen (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - var TB den største dræber (~ 10.000 til 15.000 / 100.000 indbyggere)2. Med administrationen af BCG og nem adgang til første og anden linje anti-TB-lægemidler er TB-relaterede dødsfald i 2022 dramatisk faldet til ~ 1 million / år i 2022 (dvs. ~ 15-20 / 100,000 befolkning1). I TB-endemiske befolkninger i verden ligger TB-relaterede dødsfald imidlertid fortsat på ~ 100-550/100.000 befolkning1. Mens eksperter anerkender flere grunde, der fører til disse skæve tal, synes BCG-medieret beskyttelse, der ikke varer i selv det første årti af livet, at være den fremtrædende årsag 3,4,5,6,7. I betragtning af FN's fornyede "mål for bæredygtig udvikling" og WHO's "End TB-strategi" er der derfor en samordnet global indsats for at udvikle et meget overlegent vaccinealternativ til BCG, der måske giver livslang beskyttelse mod TB.

For at nå dette mål evaluerer flere grupper i øjeblikket modificerede/rekombinante BCG-stammer, andre ikke-patogene og svækkede mykobakterielle arter end BCG og underenhedskandidaterne 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Typisk er underenhedsvacciner liposomer, der selektivt er fyldt med få rensede (~ 1-6) fuldlængde eller afkortede immunogene proteiner fra patogenet. På grund af deres falske foldning i ikke-indfødte konformationer og / eller tilfældige ikke-funktionelle interaktioner mellem de indlæste proteiner mangler underenheder ofte indfødte og tyske epitoper og undlader derfor at prime immunsystemet tilstrækkeligt14,19,20.

Derfor har ekstracellulære vesikler (EV'er) af bakterier taget fart som et lovende alternativ 21,22,23,24,25,26. Typisk indeholder bakterielle EV'er (bEV'er) en delmængde af deres cellulære komponenter, herunder nogle dele af nukleinsyrer, lipider og hundredvis af metabolitter og proteiner27,28. I modsætning til liposomer, hvor nogle få oprensede proteiner er kunstigt indlæst, indeholder bEV'er hundredvis af naturligt belastede, naturligt foldede proteiner med en bedre tilbøjelighed til at prime immunsystemet, især uden boost / hjælp fra adjuvanser og Toll-like receptor (TLR) agonister27,28,29. Det er i denne forskningslinje, at vi og andre har udforsket nytten af mykobakterielle EV'er som potentielle underenhedsboostere til BCG30. På trods af bekymringer om, at bEV'er mangler ensartede antigenbelastninger, har EV'er fra svækket Neisseria meningitidis med succes beskyttet mennesker mod serogruppe B meningococcus31,32.
I det mindste teoretisk set er de bedste elbiler, der kan øge BCG godt, elbiler beriget med patogene bakterier. Imidlertid er berigende elbiler genereret af patogen mycobacterium dyrt, tidskrævende og risikabelt. Derudover kan patogengenererede elbiler være mere virulente end beskyttende. I betragtning af de potentielle risici rapporterer vi her en veltestet protokol til berigelse af elbiler genereret af axenisk dyrket Msm, en avirulent mycobakterie.
På trods af kodning af flere patogenproteinortologer mangler avirulente mykobakterier imidlertid flere vaccineantigener/patogene proteinepitoper, der er nødvendige for at forberede immunsystemet tilstrækkeligt til beskyttelse33. Derfor undersøgte vi også konstruktion og berigelse af rekombinante EV'er af Msm gennem molekylær teknik, således at en betydelig del af ethvert patogent protein af interesse udtrykt og oversat i Msm, skal nå sine EV'er. Vi antog, at et eller flere af de 10 bedste rigelige proteiner i MSM EV'er, når de smeltes sammen med proteinet af interesse, vil hjælpe med en sådan translokation.
Mens vi begyndte at standardisere berigelsen af mykobakterielle EV'er (mEV'er) i vores laboratorium, rapporterede Prados-Rosales et al. i 2011 først visualisering og berigelse af mEV'er in vitro30. Senere, i 2014, offentliggjorde den samme gruppe en modificeret version af deres 2011-metode34. I 2015 rapporterede Lee et al. også en uafhængigt standardiseret metode til mEV-berigelse igen fra axeniske kulturer af mykobakterier35. Ved at kombinere begge protokoller 34,35 og inkorporere et par af vores ændringer efter grundig standardisering beskriver vi her en protokol, der hjælper rutinemæssigt med at berige mEV'er fra axeniske kulturer af mykobakterier36.
Her beskriver vi især berigelsen af Msm-specifikke elbiler, som er en udvidelse af en offentliggjort protokol36 til berigelse af mykobakterielle elbiler generelt. Vi beskriver også, hvordan man konstruerer rekombinante mEV'er (R-mEV'er), der indeholder mCherry-proteinet (som en rød fluorescerende reporter) og EsxA (Esat-6)37,38,39, et dominerende immunogen og en potentiel underenhed vaccinogen af Mycobacterium tuberculosis. Protokollen til berigelse af R-mEV'erne forbliver identisk med den, vi har beskrevet til berigelse af native EV'er fra Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

De fleste bakterier, herunder mykobakterier, genererer ekstracellulære vesikler (EV'er). Da bakterielle EV'er (bEV'er) indeholder en delmængde af cellulære komponenter, herunder metabolitter, lipider, proteiner og nukleinsyrer, har flere grupper evalueret enten de indfødte eller rekombinante versioner af bEV'er for deres beskyttende styrke som underenhedsvaccinekandidater. I modsætning til native EV'er er rekombinante EV'er molekylært konstrueret til at indeholde et eller flere immunogener af interesse. I løbet af det sidste årti har forskellige grupper udforsket forskellige tilgange til generering af rekombinante bEV'er. Men her rapporterer vi design, konstruktion og berigelse af rekombinante mykobakterielle EV'er (mEV'er) i mykobakterier. Til det formål bruger vi Mycobacterium smegmatis (Msm), en avirulent jordmykobakterie som modelsystem. Vi beskriver først generering og berigelse af indfødte elbiler af Msm. Derefter beskriver vi design og konstruktion af rekombinante mEV'er, der indeholder enten mCherry, et rødt fluorescerende reporterprotein, eller EsxA (Esat-6), et fremtrædende immunogen af Mycobacterium tuberculosis. Vi opnår dette ved separat at fusionere mCherry og EsxA N-termini med C-terminalen af et lille MSM-protein Cfp-29. Cfp-29 er et af de få rigeligt tilstedeværende proteiner i MsmEV'er. Protokollen til generering og berigelse af rekombinante mEV'er fra Msm forbliver identisk med generering og berigelse af native EV'er af Msm.

Vi bruger M. smegmatis (Msm) som model mycobacterium til at demonstrere berigelsen af både native og rekombinante mEV'er (R-mEV'er). Denne skematisk opsummerede mEVs berigelsesprotokol (figur 1) fungerer også til berigelse af R-mEV'er af Msm og native EV'er af Mtb (med mindre ændringer som i protokolnoter af 1.2). Visualisering af de berigede mEV'er kræver negativ farvning under et transmissionselektronmikroskop36 (figur 2A)....

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Denne protokol beskriver berigelsen af indfødte mykobakterielle ekstracellulære vesikler (mEV'er) fra axeniske kulturer af Mycobacterium smegmatis (Msm), og hvordan mCherry (en rød fluorescerende reporter) -indeholdende rekombinante MsmEV'er kan designes og beriges. Endelig verificerer den den nye tilgang med berigelse af MsmEV'er, der indeholder EsxA-proteinet fra Mycobacterium tuberculosis.

Berigelse af indfødte og rekombinante ekstracellulære vesikler af mykobakterier

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Berigende mykobakterielle elbiler hjælper med at afgrænse deres indhold, dechifrere deres fraktioner og datoer og designe måder at konstruere og generere rekombinante elbiler, der hovedsageligt udnytter vaccinekandidater. Seks serier genererer fra forskellige steder af bakterieoverfladen. De har ikke konserverede markører.Derfor kan enhver affinitetsbaseret tilgang kun berige en delmængde af elbilerne. I modsætning hertil fanger vores metode alle genererede mykobakterie-elbiler. Demonstration af proceduren vil være Mohd Ilyas, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium.Til at begynde med tilsættes en milliliter glycerolbestand af vildtype eller rekombinant Mycobacterium smegmatis til et 50 ml centrifugerør indeholdende 10 ml forvarmet 7H9 bouillon. Luk låget og hvirvl røret, før du inkuberer kulturen natten over ved 37 grader Celsius mellem 200 og 220 RPM. Den næste dag, når den optiske densitet ved 600 nanometer når ca. en, centrifugeres kulturen ved 3.200 G i 10 minutter ved stuetemperatur og kasseres supernatanten i en væskekasseringsbeholder.Tilsæt en milliliter forvarmet Sautons medie og resuspender forsigtigt for at opnå en ensartet suspension. Der fyldes op til 10 ml ved hjælp af Sautons medier. Der centrifugeres igen, og supernatanten kasseres.Efter vask resuspenderes bakteriecellerne. i 20 ml forvarmede Sautons medier og måle den optiske tæthed ved 600 nanometer. Pod det krævede volumen bakteriel suspension i en en til to liter Erlenmeyerkolbe indeholdende 330 ml Sautons medier og inkuber ved 37 grader Celsius i 200 RPM, indtil den optiske densitet når 0,3.Den næste dag vaskes cellerne en gang som tidligere demonstreret og resuspenderes pelleten i 330 ml sautoner indeholdende 1/10 Tween 80. Der fordeles 50 ml af cellesuspensionen i seks en-liters kolber, der hver indeholder 280 ml forvarmede sauton indeholdende 1/10 Tween 80. Inkuber kulturerne ved 37 grader Celsius i 200 RPM, indtil den optiske densitet når to til 2,5.Tilsæt to liter mid-eksponentielle scenekulturer til seks 400 ml flasker og centrifuger ved 8.000 G i 20 minutter ved fire grader Celsius. Supernatanten og forkølede autoklaverede kolber eller bægerglas opsamles, og en delprøve af pellet oplagres til analyse. Pelleten er farvet, hvis elbilerne er rekombinante for mCherry og brune, hvis de er vildtype eller rekombinante for ikke-fluorescerende proteiner.Kultursupernatanten filtreres gennem et 0,45 mikron bortskaffelsesfilter efterfulgt af filtrering gennem et 0,22 mikron filter for at fjerne alle spor af bakterier. Derefter forvaskes 30 kilodaltonmembrankoncentratorerne med 15 ml dobbeltdestilleret vand ved 4.000 G i 20 minutter ved fire grader Celsius. Vask derefter med 15 ml forfiltrerede kolde Sauton-medier under de samme betingelser for at fjerne alle spor af kemikalier.Efter vask tilsættes 15 ml filtreret dyrket supernatant i en koncentrator og koncentreres ved 4.000 G i 20 minutter ved fire grader Celsius. Overfør koncentratet til et koldt 40 ml Oak Ridge centrifugerør eller et 50 ml frisk Falcon centrifugerør. Når hele to liter kulturfiltrat er koncentreret, overføres koncentratet til et dobbeltdestilleret, vasket og forkølet 50 ml polypropylencentrifugerør og udsættes for en totrinscentrifugering.Først ved 4.000 G og derefter ved 15.000 G.Overfør det centrifugerede koncentrat til et forkølet 38, 5 ml ultracentrifugerør og drej ved 100.000 G i fire timer ved fire grader Celsius. Supernatanten opsamles i et forkølet 50 ml frisk Falcon-centrifugeglas. Vend ultracentrifugerøret på et frisk, fnugfrit absorberende papir for at fjerne spor af supernatanten, og pellet resuspenderes i 600 mikroliter HEPES-buffer.Lag den resuspenderede pellet i bunden af et 13 ml forkølet UltraClear polypropylen ultracentrifugerør og bland forsigtigt med fire ml inert 60% densitetsgradientiodixanolopløsning. Derefter overlejres med en milliliter hver på 40% 30% 20% og 10% iodixanol. Fyld røret ved at tilføje fire milliliter 6% iodixanol øverst.Efter omhyggelig vejning af røret i et glasbæger eller et stativ, overfør det forsigtigt ind i de svingende spande og derefter til den svingende skovlrotor til ultracentrifugering ved 141.000 G i 16 timer ved fire grader Celsius. Efter ultracentrifugering fjernes røret forsigtigt og opsamles en milliliter fraktion i autoklaverede mikrocentrifugerør. TEM-analyse viste, at mykobakterielle elbiler er cirkulære, og nanosporingsanalyse bekræftede elbiler i forskellige størrelser med diametre mellem 20 og 250 nanometer.Da den N-terminale ende af mCherry blev translationelt smeltet sammen med den C-terminale ende af CFP-29, blev en del af berigede mEV'er af Msm lyserøde, hvilket indikerer cf-29's evne til at bære et fremmed protein af interesse. CFP-29 blev derefter brugt til at evaluere EsxA-levering til MSM-elbiler. Mtb's EsxA blev observeret i MSM EV'er i små mængder.CFP-29 EsxA 3X FLAG var mere stabil og akkumulerede på højere niveauer i mEV'er. Berigelse af elbiler fra mykobakterier dyrket under fysiologisk forskellige forhold giver indsigt i deres ændrede indhold og modificerede funktioner, der dikterer vedvarende infektivitet, patogenese og patogenspredning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion og Titering af rekombinant adeno-associeret virale vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redning af rekombinant Newcastle Disease-virus fra cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Visualisering af trækul Agar Resazurin Assay til Semi-kvantitativ, Medium-throughput Tælling af mykobakterier

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry at analysere Antigen Spectra af Virioner og ekstracellulære vesikler

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler fra voksen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolering af ekstracellulære vesikler fra Murine Bronchoalveolar Lavage væske ved hjælp af en ultrafiltrering centrifugering teknik

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generation, forstærkning og titrering af rekombinant respiratorisk Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...