Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

De auteurs danken Prof. Sarah M. Fortune oprecht voor het vriendelijk delen van M. smegmatis mc2155 voorraad. Ze erkennen ook Servier Medical Art (smart.servier.com) voor het leveren van enkele basiselementen voor figuur 1. Ze erkennen oprecht de steun van de rest van de laboratoriumleden voor hun patiëntaanpassingen tijdens het lange gebruik van de couveuseschudders, centrifuges en ultracentrifuges voor mEV-verrijking. Ze erkennen ook de heer Surjeet Yadav, de laboratoriumassistent, omdat hij er altijd voor zorgde dat het benodigde glaswerk en verbruiksartikelen altijd beschikbaar en handig waren. Ten slotte erkennen ze de administratieve, aankoop- en financiële teams van THSTI voor hun constante ondersteuning en hulp bij de naadloze uitvoering van het project.

1. Groeiomstandigheden van Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli en hun derivaten
<ol><li>Media<ol><li>Middlebrook 7H9 vloeibare bouillon<ol><li>Bereid 20% Tween-80 bouillonoplossing door het benodigde volume dubbel gedestilleerd water (ddw) in een glazen bekerglas voor te verwarmen tot ~45-50 °C in een magnetron, voeg het vereiste volume Tween-80 toe met behulp van een geschikte maatcilinder en roer continu op een kleine magnetische r...

Aangezien het ontwikkelen van een nieuw tbc-vaccin dat superieur is aan BCG en het kan vervangen, een formidabele uitdaging blijft, streven verschillende groepen als alternatief naar de ontdekking van verschillende subeenheid tbc-vaccins die de potentie van BCG kunnen vergroten en de beschermende duur kunnen verlengen48,49. Gezien de toenemende aandacht voor bacteriële EV's (bEV's) als potentiële subeenheden en als natuurlijke hulpstoffen50,51...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Ondanks de ontwikkeling en toediening van een breed scala aan vaccins tegen infectieziekten, vindt zelfs tot op de dag van vandaag ~30% van alle menselijke sterfgevallen nog steeds plaats door overdraagbare ziekten. Vóór de komst van het tuberculosevaccin (tbc) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - was tuberculose doodsoorzaak nummer één (~10.000 tot 15.000/100.000 inwoners)2. Met de toediening van BCG en gemakkelijke toegang tot eerste- en tweedelijns anti-tbc-medicijnen, is het aantal tbc-gerelateerde sterfgevallen in 2022 dramatisch gedaald tot ~1 miljoen/jaar in 2022 (d.w.z. ~15-20/100.000 inwoners1). In tbc-endemische populaties van de wereld blijven tbc-gerelateerde sterfgevallen echter ~100-550/100.000 inwoners1. Hoewel experts verschillende redenen erkennen die tot deze scheve cijfers leiden, lijkt BCG-gemedieerde bescherming die zelfs het eerste decennium van het leven niet duurt, de belangrijkste reden te zijn 3,4,5,6,7. Bijgevolg is er, gezien de vernieuwde 'Sustainable Development Goals' van de VN en de 'End TB Strategy' van de WHO, een gezamenlijke wereldwijde inspanning om een veel beter vaccinalternatief voor BCG te ontwikkelen dat misschien levenslange bescherming tegen tuberculose biedt.

Om dat doel te bereiken, evalueren verschillende groepen momenteel gemodificeerde/recombinante BCG-stammen, niet-pathogene en verzwakte mycobacteriële soorten anders dan BCG, en subeenheidkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Doorgaans zijn subeenheidvaccins liposomen die selectief zijn geladen met enkele gezuiverde (~1-6) volledige of afgeknotte immunogene eiwitten van de ziekteverwekker. Echter, vanwege hun onechte vouwen in niet-inheemse conformaties en/of willekeurige niet-functionele interacties tussen de geladen eiwitten, missen subeenheden vaak native en germane epitopen en slagen ze er daarom niet in om het immuunsysteem voldoende te primen14,19,20.

Bijgevolg zijn extracellulaire blaasjes (EV's) van bacteriën in een stroomversnelling gekomen als een veelbelovend alternatief 21,22,23,24,25,26. Doorgaans bevatten bacteriële EV's (bEV's) een subset van hun cellulaire componenten, waaronder enkele delen nucleïnezuren, lipiden en honderden metabolieten en eiwitten27,28. In tegenstelling tot liposomen waar een paar gezuiverde eiwitten kunstmatig worden geladen, bevatten bEV's honderden natuurlijk geladen, native-gevouwen eiwitten met een betere neiging om het immuunsysteem te stimuleren, vooral zonder de boost/hulp van adjuvantia en Toll-like receptor (TLR) agonisten27,28,29. Het is in deze onderzoekslijn dat wij en anderen het nut van mycobacteriële EV's hebben onderzocht als potentiële subunit-boosters voor BCG30. Ondanks de bezorgdheid dat bEV's geen uniforme antigeenbelasting hebben, hebben EV's van verzwakte Neisseria meningitidis mensen met succes beschermd tegen serogroep B-meningokokken31,32.
In ieder geval theoretisch zijn de beste EV's die BCG goed zouden kunnen stimuleren de EV's die zijn verrijkt met pathogene bacteriën. Het verrijken van EV's gegenereerd door pathogene mycobacterium is echter duur, tijdrovend en riskant. Bovendien kunnen door ziekteverwekkers gegenereerde EV's virulenter dan beschermend zijn. Gezien de potentiële risico's rapporteren we hier een goed getest protocol voor de verrijking van EV's gegenereerd door axenisch gekweekte Msm, een avirulente mycobacterie.
Ondanks het feit dat ze coderen voor verschillende orthologen van pathogene eiwitten, missen avirulente mycobacteriën verschillende vaccinantigenen/pathogene eiwitepitopen die nodig zijn om het immuunsysteem voldoende voor te bereiden op bescherming33. Daarom hebben we ook onderzoek gedaan naar het construeren en verrijken van recombinante EV's van Msm door middel van moleculaire engineering, zodat een aanzienlijk deel van elk pathogeen eiwit dat van belang is en wordt uitgedrukt en vertaald in Msm, zijn EV's moet bereiken. We veronderstelden dat een of meer van de top 10 overvloedige eiwitten van Msm EV's, wanneer ze worden gefuseerd met het eiwit van belang, zullen helpen bij een dergelijke translocatie.
Terwijl we begonnen met het standaardiseren van de verrijking van mycobacteriële EV's (mEV's) in ons laboratorium, rapporteerden Prados-Rosales et al. in 2011 voor het eerst de visualisatie en verrijking van mEV's in vitro30. Later, in 2014, publiceerde dezelfde groep een aangepaste versie van hun methode uit 201134. In 2015 rapporteerden Lee et al. ook een onafhankelijk gestandaardiseerde methode voor mEV-verrijking, opnieuw uit axenische culturen van mycobacteriën35. Door beide protocollen 34,35 te combineren en enkele van onze wijzigingen op te nemen na grondige standaardisatie, beschrijven we hier een protocol dat helpt bij het routinematig verrijken van mEV's uit axenische culturen van mycobacteriën36.
Hier beschrijven we in het bijzonder de verrijking van Msm-specifieke EV's, wat een uitbreiding is van een gepubliceerd protocol36 voor de verrijking van mycobacteriële EV's in het algemeen. We beschrijven ook hoe we recombinante mEV's (R-mEV's) kunnen construeren die het mCherry-eiwit bevatten (als een rode fluorescerende reporter) en EsxA (Esat-6)37,38,39, een overheersend immunogeen en een potentiële subeenheid vaccinogeen van Mycobacterium tuberculosis. Het protocol voor het verrijken van de R-mEV's blijft identiek aan het protocol dat we hebben beschreven voor het verrijken van native EV's van Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

De meeste bacteriën, waaronder mycobacteriën, genereren extracellulaire blaasjes (EV's). Aangezien bacteriële EV's (bEV's) een subset van cellulaire componenten bevatten, waaronder metabolieten, lipiden, eiwitten en nucleïnezuren, hebben verschillende groepen de native of recombinante versies van bEV's geëvalueerd op hun beschermende potentie als subeenheid-vaccinkandidaten. In tegenstelling tot native EV's zijn recombinante EV's moleculair gemanipuleerd om een of meer immunogenen van belang te bevatten. In het afgelopen decennium hebben verschillende groepen verschillende benaderingen onderzocht voor het genereren van recombinante bEV's. Hier rapporteren we echter het ontwerp, de constructie en de verrijking van recombinante mycobacteriële EV's (mEV's) in mycobacteriën. Daarvoor gebruiken we Mycobacterium smegmatis (Msm), een avirulente bodemmycobacterie als modelsysteem. We beschrijven eerst de generatie en verrijking van native EV's van Msm. Vervolgens beschrijven we het ontwerp en de constructie van recombinante mEV's die ofwel mCherry bevatten, een rood fluorescerend reportereiwit, ofwel EsxA (Esat-6), een prominent immunogeen van Mycobacterium tuberculosis. Dit bereiken we door mCherry en EsxA N-termini afzonderlijk te fuseren met de C-terminus van een klein Msm-eiwit Cfp-29. Cfp-29 is een van de weinige overvloedig aanwezige eiwitten van MsmEV's. Het protocol voor het genereren en verrijken van recombinante mEV's uit Msm blijft identiek aan het genereren en verrijken van native EV's van Msm.

We gebruiken M. smegmatis (Msm) als model mycobacterium om de verrijking van zowel native als recombinante mEV's (R-mEV's) aan te tonen. Dit schematisch samengevatte mEV's verrijkingsprotocol (Figuur 1) werkt ook voor de verrijking van R-mEV's van Msm en native EV's van Mtb (met kleine aanpassingen zoals in protocolnotities van 1.2). Voor de visualisatie van de verrijkte mEV's moeten ze negatief worden gekleurd onder een transmissie-elektronenmicroscoop36 (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV's) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV's kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV's die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Het verrijken van mycobacteriële EV's helpt bij het afbakenen van hun inhoud, het ontcijferen van hun facties en het ontwerpen van manieren om recombinante EV's te construeren en te genereren die voornamelijk gebruik maken van kandidaat-vaccins. Zes reeksen genereren uit verschillende locaties van het bacteriële oppervlak. Ze hebben geen geconserveerde markeringen.Daarom kunnen op affiniteit gebaseerde benaderingen slechts een subset van de EV's verrijken. Onze methode daarentegen vangt alle gegenereerde mycobacteriën EV's op. De procedure wordt gedemonstreerd door Mohd Ilyas, een promovendus uit mijn laboratorium.Voeg om te beginnen een milliliter glycerolbouillon van wildtype of recombinant Mycobacterium smegmatis toe aan een centrifugebuis van 50 milliliter met 10 milliliter voorverwarmde 7H9-bouillon. Sluit het deksel en draai de buis rond voordat u de cultuur een nacht incubeert bij 37 graden Celsius tussen 200 en 220 RPM. De volgende dag, wanneer de optische dichtheid bij 600 nanometer ongeveer één bereikt, centrifugeert u de cultuur bij 3.200 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gooit u het supernatans weg in een vloeibare weggooicontainer.Voeg een milliliter voorverwarmde Sautons-media toe en resuspendeer voorzichtig om een uniforme suspensie te verkrijgen. Vul het volume aan tot 10 milliliter met behulp van Sautons-media. Centrifugeer opnieuw en gooi het supernatant weg.Na het wassen de bacteriecellen resuspenderen. in 20 milliliter voorverwarmde Sautons-media en meet de optische dichtheid op 600 nanometer. Inoculeer het benodigde volume bacteriële suspensie in een erlenmeyer van één tot twee liter met 330 milliliter Sautons-media en incubeer bij 37 graden Celsius in 200 RPM totdat de optische dichtheid 0,3 bereikt.Was de cellen de volgende dag één keer zoals eerder aangetoond en resuspendeer de pellet in 330 milliliter Sautons met 1/10 Tween 80. Verdeel 50 milliliter van de celsuspensie over zes kolven van één liter, elk met 280 milliliter voorverwarmde Sautons met 1/10 Tween 80. Incubeer de culturen bij 37 graden Celsius in 200 RPM totdat de optische dichtheid twee tot 2,5 bereikt.Voeg twee liter culturen in het midden van het exponentiële stadium toe aan zes flessen van 400 milliliter en centrifugeer bij 8.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatans en de voorgekoelde geautoclaveerde kolven of bekers en bewaar een hoeveelheid van de pellet voor analytische procedures. De pellet is gekleurd als de EV's recombinant zijn voor mCherry en bruin als ze wild-type zijn of recombinant voor niet-fluorescerende eiwitten.Filtreer het kweeksupernatans door een verwijderingsfilter van 0,45 micron, gevolgd door filtratie door een filter van 0,22 micron om alle sporen van bacteriën te verwijderen. Was vervolgens de 30 kilodalton membraanconcentrators voor met 15 milliliter dubbel gedestilleerd water op 4.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Was vervolgens met 15 milliliter voorgefilterde koude Sautons-media onder dezelfde omstandigheden om alle sporen van chemicaliën te verwijderen.Voeg na het wassen 15 milliliter gefilterd gekweekt supernatans toe aan een concentrator en concentreer op 4.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Breng het concentraat over in een koude Oak Ridge centrifugebuis van 40 milliliter of een verse Falcon centrifugebuis van 50 milliliter. Zodra de volledige twee liter kweekfiltraat is geconcentreerd, brengt u het concentraat over in een dubbel gedestilleerde, gewassen en voorgekoelde polypropyleen centrifugebuis van 50 milliliter en onderwerpt u deze aan een centrifugatie in twee stappen.Eerst bij 4.000 G en vervolgens bij 15.000 G.Breng het gecentrifugeerde concentraat over in een voorgekoelde ultracentrifugebuis van 38,5 milliliter en draai vier uur lang bij 100.000 G bij vier graden Celsius. Vang het supernatans op in een voorgekoelde verse Falcon-centrifugebuis van 50 milliliter. keer de ultracentrifugebuis om op vers, pluisvrij absorberend papier om sporen van het supernatans te verwijderen en resuspendeer de pellet in 600 microliter HEPES-buffer.Leg de geresuspendeerde pellet op de bodem van een voorgekoelde UltraClear polypropyleen ultracentrifugebuis van 13 milliliter en meng voorzichtig met vier milliliter inerte jodixanoloplossing met een dichtheidsgradiënt van 60%. Bedek vervolgens met een milliliter elk van 40% 30% 20% en 10% jodixanol. Vul de tube door aan de bovenkant vier milliliter 6% jodixanol toe te voegen.Na het zorgvuldig wegen van de buis in een glazen bekerglas of een standaard, brengt u deze voorzichtig over in de zwaaiemmers en vervolgens in de rotor van de zwaaiemmer voor ultracentrifugatie bij 141.000 G gedurende 16 uur bij vier graden Celsius. Verwijder na ultracentrifugatie voorzichtig de buis en verzamel een fractie van één milliliter in geautoclaveerde microcentrifugebuisjes. TEM-analyse toonde aan dat mycobacteriële EV's cirkelvormig zijn en nano-tracking-analyse bevestigde EV's van verschillende grootte met diameters variërend tussen 20 en 250 nanometer.Toen het N-terminale uiteinde van mCherry translationeel werd gefuseerd met het C-terminale uiteinde van CFP-29, werd een deel van de verrijkte mEV's van Msm roze, wat wijst op het vermogen van cf-29 om een vreemd eiwit van belang te dragen. CFP-29 werd vervolgens gebruikt om de levering van EsxA in Msm EV's te evalueren. Mtb's EsxA werd waargenomen in Msm EV's in kleine hoeveelheden.CFP-29 EsxA 3X FLAG was stabieler en accumuleerde op hogere niveaus in mEV's. Het verrijken van de EV's van mycobacteriën die onder fysiologisch verschillende omstandigheden worden gekweekt, geeft inzicht in hun veranderde inhoud en gewijzigde functies die aanhoudende besmettelijkheid, pathogenese en verspreiding van pathogenen dicteren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Peptide: MHC tetrameer-gebaseerde verrijking van epitoop-specifieke T-cellen

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...