Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Les auteurs remercient sincèrement le professeur Sarah M. Fortune d’avoir aimablement partagé le stock de M. smegmatis mc2155. Ils remercient également Servier Medical Art (smart.servier.com) d’avoir fourni quelques éléments de base pour la figure 1. Ils remercient sincèrement le soutien des autres membres du laboratoire pour leurs ajustements patients pendant la longue utilisation des agitateurs d’incubateur, des centrifugeuses et des ultracentrifugeuses pour l’enrichissement en mEV. Ils remercient également M. Surjeet Yadav, l’assistant de laboratoire, de toujours s’assurer que la verrerie et les consommables nécessaires étaient toujours disponibles et à portée de main. Enfin, ils remercient les équipes administratives, d’achat et financières de THSTI pour leur soutien constant et leur aide dans la bonne exécution du projet.

1. Conditions de croissance de Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli et de leurs dérivés
<ol><li>Média<ol><li>Bouillon liquide Middlebrook 7H9<ol><li>Préparez la solution mère Tween-80 à 20 % en préchauffant le volume requis d’eau doublement distillée (ddw) dans un bécher en verre à ~45-50 °C au micro-ondes, ajoutez le volume requis de Tween-80 à l’aide d’une éprouvette de mesure appropriée et remuez continuellement ...

Étant donné que la mise au point d’un nouveau vaccin antituberculeux supérieur au BCG et capable de le remplacer reste un défi de taille, plusieurs groupes poursuivent la découverte de différents vaccins antituberculeux sous-unitaires capables d’augmenter la puissance du BCG et de prolonger sa durée de protection48,49. Compte tenu de l’attention croissante portée aux VE bactériennes (bEV) en tant que sous-unités potentielles et adjuvants naturels<...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Malgré le développement et l’administration d’une large gamme de vaccins contre les maladies infectieuses, encore aujourd’hui, ~30 % de tous les décès humains sont dus à des maladies transmissibles1. Avant l’avènement du vaccin antituberculeux (TB) - Bacillus Calmette Guérin (BCG) - la tuberculose était la première cause de mortalité (~10 000 à 15 000/100 000 habitants)2. Grâce à l’administration du BCG et à l’accès facile aux médicaments antituberculeux de première et de deuxième intention, en 2022, le nombre de décès liés à la tuberculose a considérablement chuté à ~1 million/an en 2022 (c’est-à-dire ~15-20/100 000 habitants1). Cependant, dans les populations endémiques de tuberculose dans le monde, les décès liés à la tuberculose continuent de se situer entre ~100 et 550/100 000 habitants1. Bien que les experts reconnaissent plusieurs raisons conduisant à ces chiffres faussés, la protection médiée par le BCG ne dure même pas pendant la première décennie de la vie semble être la principale raison 3,4,5,6,7. Par conséquent, compte tenu des « Objectifs de développement durable » renouvelés de l’ONU et de la « Stratégie pour mettre fin à la tuberculose » de l’OMS, il y a un effort mondial concerté pour développer une alternative vaccinale bien supérieure au BCG qui offre peut-être une protection à vie contre la tuberculose.

Pour atteindre cet objectif, plusieurs groupes évaluent actuellement des souches modifiées/recombinantes du BCG, des espèces mycobactériennes non pathogènes et atténuées autres que le BCG, et des sous-unités candidates 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . En règle générale, les vaccins sous-unitaires sont des liposomes chargés sélectivement avec peu de protéines immunogènes purifiées (~1-6) de longueur complète ou tronquée de l’agent pathogène. Cependant, en raison de leur repliement parasite en conformations non natives et/ou d’interactions aléatoires non fonctionnelles entre les protéines chargées, les sous-unités manquent souvent d’épitopes natifs et germaniques et, par conséquent, ne parviennent pas à amorcer suffisamment le système immunitaire14,19,20.

Par conséquent, les vésicules extracellulaires (VE) des bactéries ont pris de l’ampleur en tant qu’alternative prometteuse 21,22,23,24,25,26. En règle générale, les VE bactériennes (bEV) contiennent un sous-ensemble de leurs composants cellulaires, y compris certaines portions d’acides nucléiques, de lipides et des centaines de métabolites et de protéines27,28. Contrairement aux liposomes où quelques protéines purifiées sont chargées artificiellement, les bEV contiennent des centaines de protéines naturellement chargées, repliées nativement, avec une meilleure propension à amorcer le système immunitaire, en particulier sans le coup de pouce / l’aide d’adjuvants et d’agonistes des récepteurs de type Toll (TLR)27,28,29. C’est dans cette ligne de recherche que nous et d’autres avons exploré l’utilité des VE mycobactériennes en tant que boosters potentiels de sous-unités du BCG30. Malgré les inquiétudes selon lesquelles les bEV n’ont pas de charges antigéniques uniformes, les VE de Neisseria meningitidis atténué ont réussi à protéger les humains contre le méningocoque du sérogroupeB 31,32.
Du moins en théorie, les meilleurs VE qui pourraient bien booster le BCG sont les VE enrichis en bactéries pathogènes. Cependant, l’enrichissement des VE générées par des mycobactéries pathogènes est coûteux, long et risqué. De plus, les VE générées par des agents pathogènes peuvent être plus virulentes que protectrices. Compte tenu des risques potentiels, nous rapportons ici un protocole bien testé pour l’enrichissement des VE générées par le Msm cultivé axéniquement, une mycobactérie avirulente.
Cependant, bien qu’elles codent pour plusieurs orthologues de protéines pathogènes, les mycobactéries avirulentes manquent de plusieurs antigènes vaccinaux/épitopes protéiques pathogènes nécessaires pour préparer suffisamment le système immunitaire à la protection33. Par conséquent, nous avons également exploré la construction et l’enrichissement des VE recombinantes de Msm par ingénierie moléculaire, de sorte qu’une partie importante de toute protéine pathogène d’intérêt exprimée et traduite en Msm, doit atteindre ses EV. Nous avons émis l’hypothèse qu’une ou plusieurs des 10 protéines les plus abondantes des VE Msm, lorsqu’elles sont fusionnées à la protéine d’intérêt, aideront à une telle translocation.
Alors que nous commencions à standardiser l’enrichissement des VE mycobactériennes (mEVs) dans notre laboratoire, en 2011, Prados-Rosales et al. ont rapporté pour la première fois la visualisation et l’enrichissement des mEVs in vitro30. Plus tard, en 2014, le même groupe a publié une version modifiée de sa méthode34 de 2011. En 2015, Lee et al. ont également fait état d’une méthode standardisée indépendante pour l’enrichissement en mEV à partir de cultures axéniques de mycobactéries35. En combinant les deux protocoles34,35 et en incorporant quelques-unes de nos modifications après une standardisation approfondie, nous décrivons ici un protocole qui permet d’enrichir régulièrement les mEVs à partir de cultures axéniques de mycobactéries 36.
Ici, nous détaillons particulièrement l’enrichissement des VE spécifiques au MSM, qui est une extension d’un protocole publié36 pour l’enrichissement des VE mycobactériennes en général. Nous détaillons également comment construire des mEVs recombinants (R-mEVs) qui contiennent la protéine mCherry (en tant que rapporteur fluorescent rouge) et EsxA (Esat-6)37,38,39, un immunogène prédominant et une sous-unité potentielle de vaccinogène de Mycobacterium tuberculosis. Le protocole d’enrichissement des R-mEVs reste identique à celui que nous avons décrit pour l’enrichissement des VE natifs à partir de Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

La plupart des bactéries, y compris les mycobactéries, génèrent des vésicules extracellulaires (VE). Étant donné que les VE bactériennes (bEV) contiennent un sous-ensemble de composants cellulaires, notamment des métabolites, des lipides, des protéines et des acides nucléiques, plusieurs groupes ont évalué les versions natives ou recombinantes des bEV pour leur pouvoir protecteur en tant que candidats vaccins sous-unitaires. Contrairement aux VE natifs, les VE recombinants sont génétiquement modifiés pour contenir un ou plusieurs immunogènes d’intérêt. Au cours de la dernière décennie, différents groupes ont exploré diverses approches pour générer des bEV recombinants. Cependant, nous rapportons ici la conception, la construction et l’enrichissement des VE mycobactériennes recombinantes (mEV) dans les mycobactéries. Pour ce faire, nous utilisons Mycobacterium smegmatis (Msm), une mycobactérie avirulente du sol comme système modèle. Nous décrivons d’abord la génération et l’enrichissement des EV natifs de Msm. Ensuite, nous décrivons la conception et la construction de mEVs recombinants qui contiennent soit mCherry, une protéine rapporteure fluorescente rouge, soit EsxA (Esat-6), un immunogène important de Mycobacterium tuberculosis. Nous y parvenons en fusionnant séparément les N-terminaisons mCherry et EsxA avec l’extrémité C d’une petite protéine Msm, Cfp-29. Cfp-29 est l’une des rares protéines abondamment présentes chez les MsmEVs. Le protocole de génération et d’enrichissement des mEVs recombinants à partir de Msm reste identique à celui de génération et d’enrichissement des EVs natifs de Msm.

Nous utilisons M. smegmatis (Msm) comme mycobactérie modèle pour démontrer l’enrichissement des mEVs natives et recombinantes (R-mEVs). Ce protocole d’enrichissement des mEVs résumé schématiquement (Figure 1) fonctionne également pour l’enrichissement des R-mEVs de Msm et des EVs natifs de Mtb (avec des modifications mineures comme dans les notes de protocole de 1.2). La visualisation des mEVs enrichis nécessite de les colorer négativement au microscope électronique ...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Ce protocole détaille l’enrichissement des vésicules extracellulaires mycobactériennes natives (mEVs) à partir de cultures axéniques de Mycobacterium smegmatis (Msm) et comment les MsmEVs recombinants contenant mCherry (un rapporteur fluorescent rouge) peuvent être conçus et enrichis. Enfin, il vérifie la nouvelle approche avec l’enrichissement de MsmEVs contenant la protéine EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enrichissement des vésicules extracellulaires natives et recombinantes de mycobactéries

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

L’enrichissement des VE mycobactériennes permet de délimiter leur contenu, de déchiffrer leurs factions et leurs dates, en concevant des moyens de construire et de générer des VE recombinantes qui exploitent principalement des candidats vaccins. Six séries sont générées à partir de différents endroits de la surface bactérienne. Ils n’ont pas de marqueurs conservés.Par conséquent, toute approche basée sur l’affinité ne peut enrichir qu’un sous-ensemble des VE. En revanche, notre méthode capture toutes les mycobactéries VE générées. Mohd Ilyas, un doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour commencer, ajoutez un millilitre de bouillon de glycérol de type sauvage ou recombinant Mycobacterium smegmatis dans un tube à centrifuger de 50 millilitres contenant 10 millilitres de bouillon 7H9 préchauffé. Fermez le couvercle et faites tourner le tube avant d’incuber la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius entre 200 et 220 tr/min. Le lendemain, lorsque la densité optique à 600 nanomètres atteint environ un, centrifugez la culture à 3 200 G pendant 10 minutes à température ambiante et jetez le surnageant dans un récipient liquide.Ajouter un millilitre de milieu de Sautons préchauffé et remettre doucement en suspension pour obtenir une suspension uniforme. Augmentez le volume à 10 millilitres à l’aide d’un média Sautons. Centrifugez à nouveau et jetez le surnageant.Après le lavage, remettez les cellules bactériennes en suspension. dans 20 millilitres de milieux Sautons préchauffés et mesurez la densité optique à 600 nanomètres. Inoculer le volume requis de suspension bactérienne dans un erlenmeyer d’un à deux litres contenant 330 millilitres de milieu Sautons et incuber à 37 degrés Celsius à 200 tr/min jusqu’à ce que la densité optique atteigne 0,3.Le lendemain, lavez les cellules une fois comme démontré précédemment et remettez la pastille en suspension dans 330 millilitres de Sautons contenant 1/10 Tween 80. Répartissez 50 millilitres de la suspension cellulaire dans six flacons d’un litre, contenant chacun 280 millilitres de Sautons préchauffés contenant 1/10 Tween 80. Incuber les cultures à 37 degrés Celsius à 200 tr/min jusqu’à ce que la densité optique atteigne deux à 2,5.Ajoutez deux litres de cultures au stade exponentiel moyen à six bouteilles de 400 millilitres et centrifugez à 8 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir les flacons surnageants et pré-réfrigérés autoclavés ou les béchers et conserver une aliquote de la pastille pour les procédures analytiques. La pastille est colorée si les VE sont recombinantes pour mCherry et brunes si elles sont de type sauvage ou recombinantes pour les protéines non fluorescentes.Filtrez le surnageant de culture à travers un filtre d’élimination de 0,45 micron, suivi d’une filtration à travers un filtre de 0,22 micron pour éliminer toute trace de bactéries. Ensuite, prélavez les concentrateurs à membrane de 30 kilodaltons avec 15 millilitres d’eau doublement distillée à 4 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Laver ensuite avec 15 millilitres de Sautons froids pré-filtrés en utilisant les mêmes conditions pour éliminer toute trace de produits chimiques.Après le lavage, ajoutez 15 millilitres de surnageant de culture filtré dans un concentrateur et concentrez à 4 000 g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le concentré dans un tube à centrifuger Oak Ridge froid de 40 millilitres ou un tube à centrifuger Falcon frais de 50 millilitres. Une fois que les deux litres de filtrat de culture sont concentrés, transférez le concentré dans un tube à centrifuger en polypropylène de 50 millilitres doublement distillé, lavé et pré-refroidi et soumis à une centrifugation en deux étapes.D’abord à 4 000 G, puis à 15 000 G.Transférez le concentré centrifugé dans un tube ultracentrifuge pré-refroidi de 38,5 millilitres et essorez-le à 100 000 G pendant quatre heures à quatre degrés Celsius. Recueillir le surnageant dans un tube à centrifuger Falcon frais de 50 millilitres pré-réfrigéré. Retournez le tube de l’ultracentrifugeuse sur un papier absorbant frais et non pelucheux pour éliminer les traces de surnageant et remettez la pastille en suspension dans 600 microlitres de tampon HEPES.Déposer la pastille remise en suspension au fond d’un tube d’ultracentrifugation en polypropylène UltraClear pré-refroidi de 13 millilitres et mélanger délicatement avec quatre millilitres de solution inerte d’iodixanol à gradient de densité de 60 %. Ensuite, superposez avec un millilitre de 40 %, 30 %, 20 % et 10 % d’iodixanol. Remplissez le tube en ajoutant quatre millilitres d’iodixanol à 6% en haut.Après avoir soigneusement pesé le tube dans un bécher en verre ou un support, transférez-le doucement dans les seaux oscillants, puis dans le rotor des godets oscillants pour l’ultracentrifugation à 141 000 G pendant 16 heures à quatre degrés Celsius. Après l’ultracentrifugation, retirez soigneusement le tube et collectez une fraction d’un millilitre dans des tubes de microcentrifugation autoclavés. L’analyse TEM a montré que les VE mycobactériens sont circulaires et l’analyse de nano-suivi a confirmé des VE de différentes tailles avec des diamètres allant de 20 à 250 nanomètres.Lorsque l’extrémité N-terminale de mCherry a été fusionnée par translation à l’extrémité C-terminale de CFP-29, une partie des mEVs enrichis de Msm est devenue rose, indiquant la capacité de cf-29 à transporter une protéine étrangère d’intérêt. Le CFP-29 a ensuite été utilisé pour évaluer la livraison d’EsxA dans les VE Msm. L’EsxA de Mtb a été observé dans les véhicules électriques Msm en faibles quantités.Le CFP-29 EsxA 3X FLAG était plus stable et s’est accumulé à des niveaux plus élevés dans les mEV. L’enrichissement des VE à partir de mycobactéries cultivées dans des conditions physiologiques différentes permet de mieux comprendre leur contenu modifié et leurs fonctions modifiées qui dictent une infectiosité, une pathogenèse et une propagation prolongées des agents pathogènes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante de production et infection rétrovirale des cellules B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Peptide: CMH tétramère basée sur l&#39;enrichissement des cellules T spécifiques d&#39;épitopes

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

Visualisation de l&#39;Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Débit Virometry pour l&#39;analyse antigénique Spectra de virions et extracellulaires Vésicules

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Isolement des vésicules extracellulaires du murin lavage broncho-alvéolaire fluide à l’aide d’une Technique de Centrifugation de l’Ultrafiltration

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...