Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
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Die Autoren danken Prof. Sarah M. Fortune herzlich für die freundliche Zurverfügungstellung von M. smegmatis mc2155 Stock. Sie danken auch Servier Medical Art (smart.servier.com) für die Bereitstellung einiger grundlegender Elemente für Abbildung 1. Sie bedanken sich aufrichtig für die Unterstützung der übrigen Labormitglieder für ihre Patientenanpassungen während der langen Nutzung der Inkubatorschüttler, Zentrifugen und Ultrazentrifugen zur mEV-Anreicherung. Sie danken auch Herrn Surjeet Yadav, dem Laborassistenten, dafür, dass er immer dafür gesorgt hat, dass die notwendigen Glaswaren und Verbrauchsmaterialien immer verfügbar und griffbereit waren. Zu guter Letzt danken sie den Verwaltungs-, Einkaufs- und Finanzteams von THSTI für ihre ständige Unterstützung und Hilfe bei der reibungslosen Durchführung des Projekts.

1. Wachstumsbedingungen von Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli und ihren Derivaten
<ol><li>Medien<ol><li>Middlebrook 7H9 flüssige Brühe<ol><li>Bereiten Sie 20%ige Tween-80-Stammlösung vor, indem Sie das erforderliche Volumen des doppelt destillierten Wassers (ddw) in einem Glasbecherglas in einer Mikrowelle auf ~45-50 °C vorwärmen, das erforderliche Volumen Tween-80 mit einem geeigneten Messzylinder hinzufügen und kontinuierli...

Da die Entwicklung eines neuartigen TB-Impfstoffs, der BCG überlegen ist und ihn ersetzen kann, nach wie vor eine große Herausforderung darstellt, verfolgen mehrere Gruppen die Entdeckung verschiedener TB-Impfstoffe mit Untereinheiten, die die Wirksamkeit von BCG steigern und seine Schutzdauer verlängern können48,49. Angesichts der zunehmenden Aufmerksamkeit für bakterielle EVs (bEVs) als potentielle Untereinheiten und als natürliche Adjuvantien<sup class="...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Trotz der Entwicklung und Verabreichung einer breiten Palette von Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten ereignen sich auch heute noch ~30% aller Todesfälle beim Menschen durch übertragbare Krankheiten1. Vor dem Aufkommen des Tuberkulose-Impfstoffs - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - war Tuberkulose die häufigste Todesursache (~10.000 bis 15.000/100.000 Einwohner)2. Mit der Verabreichung von BCG und dem einfachen Zugang zu Erst- und Zweitlinienmedikamenten gegen Tuberkulose sind die TB-bedingten Todesfälle bis 2022 dramatisch auf ~1 Million/Jahr bis 2022 gesunken (d. h. ~15-20/100.000 Einwohner1). In den TB-endemischen Populationen der Welt liegt die Zahl der TB-bedingten Todesfälle jedoch weiterhin bei ~100-550/100.000 Einwohnern1. Während Experten mehrere Gründe erkennen, die zu diesen verzerrten Zahlen führen, scheint der BCG-vermittelte Schutz, der nicht einmal im ersten Lebensjahrzehnt anhält, der Hauptgrund dafür zu sein 3,4,5,6,7. Angesichts der erneuerten "Ziele für nachhaltige Entwicklung" der Vereinten Nationen und der "Strategie zur Beendigung der Tuberkulose" der WHO gibt es daher konzertierte globale Anstrengungen, um eine viel bessere Impfstoffalternative zu BCG zu entwickeln, die möglicherweise einen lebenslangen Schutz vor Tuberkulose bietet.

Um dieses Ziel zu erreichen, evaluieren mehrere Gruppen derzeit modifizierte/rekombinante BCG-Stämme, nicht-pathogene und abgeschwächte Mykobakterienspezies außer BCG und Untereinheitenkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Typischerweise handelt es sich bei Subunit-Impfstoffen um Liposomen, die selektiv mit wenigen gereinigten (~1-6) vollständigen (~1-6) immunogenen Proteinen des Erregers beladen sind. Aufgrund ihrer unechten Faltung in nicht-native Konformationen und/oder zufälliger nicht-funktionaler Interaktionen zwischen den beladenen Proteinen fehlen den Untereinheiten jedoch oft native und germane Epitope und sie können das Immunsystem daher nicht ausreichend vorbereiten14,19,20.

Folglich haben extrazelluläre Vesikel (EVs) von Bakterien als vielversprechende Alternative an Fahrt aufgenommen 21,22,23,24,25,26. Typischerweise enthalten bakterielle EVs (bEVs) eine Teilmenge ihrer zellulären Bestandteile, darunter einige Teile von Nukleinsäuren, Lipiden und Hunderten von Metaboliten und Proteinen27,28. Im Gegensatz zu Liposomen, bei denen einige wenige gereinigte Proteine künstlich geladen werden, enthalten bEVs Hunderte von natürlich beladenen, nativ gefalteten Proteinen mit einer besseren Neigung, das Immunsystem vorzubereiten, insbesondere ohne den Schub/die Hilfe von Adjuvantien und Toll-like-Rezeptoren (TLR)-Agonisten27,28,29. In dieser Forschungsrichtung haben wir und andere den Nutzen von mykobakteriellen EVs als potenzielle Untereinheiten-Booster für BCG30 untersucht. Trotz der Befürchtungen, dass bEVs keine einheitlichen Antigenlasten aufweisen, haben EVs aus abgeschwächter Neisseria meningitidis den Menschen erfolgreich vor Meningokokken der Serogruppe B geschützt31,32.
Zumindest theoretisch sind die besten EVs, die BCG gut steigern könnten, die EVs, die mit pathogenen Bakterien angereichert sind. Die Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch pathogene Mykobakterien erzeugt werden, ist jedoch teuer, zeitaufwändig und riskant. Darüber hinaus können durch Krankheitserreger erzeugte EVs virulenter als schützend sein. Angesichts der potenziellen Risiken berichten wir hier über ein gut getestetes Protokoll zur Anreicherung von Elektrofahrzeugen, die durch axenisch gezüchtetes MSM, ein avirulentes Mykobakterium, erzeugt werden.
Trotz der Kodierung mehrerer pathogener Proteinorthologe fehlen avirulenten Mykobakterien jedoch mehrere Impfantigene/pathogene Proteinepitope, die notwendig sind, um das Immunsystem ausreichend auf den Schutz vorzubereiten33. Daher untersuchten wir auch die Konstruktion und Anreicherung rekombinanter EVs von Msm durch molekulares Engineering, so dass ein signifikanter Teil jedes pathogenen Proteins von Interesse, das in Msm exprimiert und translatiert wird, seine EVs erreichen muss. Wir stellten die Hypothese auf, dass eines oder mehrere der 10 am häufigsten vorkommenden Proteine von MSM EVs, wenn sie mit dem interessierenden Protein fusioniert werden, bei einer solchen Translokation helfen.
Während wir 2011 begannen, die Anreicherung von mykobakteriellen EVs (mEVs) in unserem Labor zu standardisieren, berichteten Prados-Rosales et al. erstmals über die Visualisierung und Anreicherung von mEVs in vitro30. Später, im Jahr 2014, veröffentlichte dieselbe Gruppe eine modifizierte Version ihrer Methode34 aus dem Jahr 2011. Im Jahr 2015 berichteten Lee et al. auch über eine unabhängig standardisierte Methode zur mEV-Anreicherung, wiederum aus axenischen Kulturen von Mykobakterien35. Durch die Kombination beider Protokolle 34,35 und die Einbeziehung einiger unserer Modifikationen nach gründlicher Standardisierung beschreiben wir hier ein Protokoll, das bei der routinemäßigen Anreicherung von mEVs aus axenischen Kulturen von Mykobakterienhilft 36.
Hier gehen wir besonders auf die Anreicherung von MSM-spezifischen EVs ein, die eine Erweiterung eines veröffentlichten Protokolls36 für die Anreicherung von mykobakteriellen EVs im Allgemeinen darstellt. Wir beschreiben auch, wie rekombinante mEVs (R-mEVs) konstruiert werden können, die das mCherry-Protein (als rot fluoreszierender Reporter) und EsxA (Esat-6)37,38,39 enthalten, ein vorherrschendes Immunogen und eine potenzielle Untereinheit des Vaccinogens von Mycobacterium tuberculosis. Das Protokoll für die Anreicherung der R-mEVs bleibt identisch mit dem, das wir für die Anreicherung nativer EVs von MSM beschrieben haben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

Die meisten Bakterien, einschließlich Mykobakterien, erzeugen extrazelluläre Vesikel (EVs). Da bakterielle EVs (bEVs) eine Untergruppe zellulärer Komponenten enthalten, darunter Metaboliten, Lipide, Proteine und Nukleinsäuren, haben mehrere Gruppen entweder die native oder die rekombinante Version von bEVs auf ihre schützende Wirksamkeit als Impfstoffkandidaten für Untereinheiten untersucht. Im Gegensatz zu nativen EVs sind rekombinante EVs molekular so konstruiert, dass sie ein oder mehrere Immunogene von Interesse enthalten. In den letzten zehn Jahren haben verschiedene Gruppen verschiedene Ansätze zur Erzeugung rekombinanter bEVs erforscht. Hier berichten wir jedoch über das Design, die Konstruktion und die Anreicherung von rekombinanten mykobakteriellen EVs (mEVs) in Mykobakterien. Zu diesem Zweck verwenden wir Mycobacterium smegmatis (Msm), ein avirulentes Bodenmykobakterium, als Modellsystem. Wir beschreiben zunächst die Generierung und Anreicherung nativer Elektrofahrzeuge von MSM. Anschließend beschreiben wir das Design und die Konstruktion von rekombinanten mEVs, die entweder mCherry, ein rot fluoreszierendes Reporterprotein, oder EsxA (Esat-6), ein prominentes Immunogen von Mycobacterium tuberculosis, enthalten. Dies erreichen wir, indem wir mCherry- und EsxA-N-Termini separat mit dem C-Terminus eines kleinen Msm-Proteins Cfp-29 fusionieren. Cfp-29 ist eines der wenigen Proteine, die in MsmEVs reichlich vorhanden sind. Das Protokoll zur Erzeugung und Anreicherung rekombinanter mEVs aus Msm bleibt identisch mit der Generierung und Anreicherung nativer EVs von MSM.

Wir verwenden M. smegmatis (Msm) als Modellmykobakterium, um die Anreicherung sowohl von nativen als auch von rekombinanten mEVs (R-mEVs) zu demonstrieren. Dieses schematisch zusammengefasste mEVs-Anreicherungsprotokoll (Abbildung 1) funktioniert auch für die Anreicherung von R-mEVs von MSM und nativen EVs von Mtb (mit geringfügigen Modifikationen wie in den Protokollanmerkungen von 1.2). Die Visualisierung der angereicherten mEVs erfordert eine negative Färbung unter einem Trans...

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Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Die Anreicherung mykobakterieller EVs hilft dabei, ihren Inhalt abzugrenzen, ihre Fraktionen zu entschlüsseln und Wege zu entwickeln, um rekombinante EVs zu konstruieren und zu generieren, die hauptsächlich Impfstoffkandidaten nutzen. Sechs Serien entstehen an unterschiedlichen Stellen der Bakterienoberfläche. Sie haben keine konservierten Marker.Daher können affinitätsbasierte Ansätze nur eine Teilmenge der Elektrofahrzeuge anreichern. Im Gegensatz dazu erfasst unsere Methode alle erzeugten Mykobakterien-EVs. Das Verfahren wird Mohd Ilyas, ein Doktorand aus meinem Labor, vorführen.Geben Sie zunächst einen Milliliter Glycerinbrühe von Wildtyp- oder rekombinantem Mycobacterium smegmatis in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das 10 Milliliter vorgewärmte 7H9-Brühe enthält. Schließen Sie den Deckel und schwenken Sie das Röhrchen, bevor Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius zwischen 200 und 220 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Am nächsten Tag, wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern etwa eins erreicht, zentrifugiert man die Kultur bei 3.200 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgt den Überstand in einen Flüssigkeitsbehälter.Fügen Sie einen Milliliter vorgewärmtes Sautons-Medium hinzu und resuspendieren Sie es vorsichtig, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Reduzieren Sie das Volumen auf 10 Milliliter mit Sautons-Medien. Zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie den Überstand.Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Bakterienzellen. in 20 Milliliter vorgewärmtem Sauton-Medium und messen die optische Dichte bei 600 Nanometern. Die erforderliche Menge an Bakteriensuspension wird in einen Ein- bis Zwei-Liter-Erlenmeyerkolben mit 330 Millilitern Sautons-Medium geimpft und bei 37 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubiert, bis die optische Dichte 0,3 erreicht.Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen einmal, wie zuvor gezeigt, und resuspendieren Sie das Pellet in 330 Milliliter Sautons, die 1/10 Tween 80 enthalten. Verteilen Sie 50 Milliliter der Zellsuspension auf sechs Ein-Liter-Kolben, die jeweils 280 Milliliter vorgewärmte Sautons enthalten, die 1/10 Tween 80 enthalten. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute, bis die optische Dichte zwei bis 2,5 erreicht.Zwei Liter Kulturen im mittleren Exponentialstadium werden in sechs 400-Milliliter-Flaschen gegeben und bei 8.000 G 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand und die vorgekühlten autoklavierten Kolben oder Bechergläser und lagern Sie ein Aliquot des Pellets für analytische Verfahren. Das Pellet ist gefärbt, wenn die EVs rekombinant für mCherry sind, und braun, wenn sie Wildtyp oder rekombinant für nicht-fluoreszierende Proteine sind.Filtern Sie den Kulturüberstand durch einen 0,45-Mikron-Entsorgungsfilter, gefolgt von einer Filtration durch einen 0,22-Mikron-Filter, um alle Spuren von Bakterien zu entfernen. Anschließend werden die 30-Kilodalton-Membrankonzentratoren mit 15 Millilitern doppelt destilliertem Wasser bei 4.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius vorgewaschen. Waschen Sie dann mit 15 Millilitern vorgefiltertem kaltem Sautons-Medium unter den gleichen Bedingungen, um alle Spuren von Chemikalien zu entfernen.Nach dem Waschen werden 15 Milliliter gefilterter Kulturüberstand in einen Konzentrator gegeben und 20 Minuten lang bei 4.000 g bei vier Grad Celsius konzentriert. Füllen Sie das Konzentrat in ein kaltes 40-Milliliter-Oak Ridge-Zentrifugenröhrchen oder ein frisches 50-Milliliter-Falcon-Zentrifugenröhrchen um. Sobald die gesamten zwei Liter Kulturfiltrat konzentriert sind, wird das Konzentrat in ein doppelt destilliertes, gewaschenes und vorgekühltes 50-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen überführt und einer zweistufigen Zentrifugation unterzogen.Zuerst bei 4.000 g, dann bei 15.000 g.Das zentrifugierte Konzentrat in ein vorgekühltes 38,5-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen überführen und bei 100.000 g vier Stunden bei vier Grad Celsius schleudern. Sammeln Sie den Überstand in einem vorgekühlten 50 Milliliter frischen Falcon-Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen auf ein frisches, fusselfreies, saugfähiges Papier, um Spuren des Überstands zu entfernen, und resuspendieren Sie das Pellet in 600 Mikroliter HEPES-Puffer.Schichten Sie das resuspendierte Pellet auf den Boden eines vorgekühlten 13-Milliliter-UltraClear-Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchens und mischen Sie es vorsichtig mit vier Millilitern inerter Iodixanol-Lösung mit 60 % Dichtegradient. Anschließend mit je einem Milliliter 40 %, 30 %, 20 % und 10 % Jodixanol überlagern. Füllen Sie das Röhrchen, indem Sie oben vier Milliliter 6%iges Jodixanol hinzufügen.Nach sorgfältigem Wiegen des Röhrchens in einem Glasbecher oder einem Ständer wird es vorsichtig in die schwingenden Eimer und dann in den Rotor der schwingenden Eimer für die Ultrazentrifugation bei 141.000 G für 16 Stunden bei vier Grad Celsius überführt. Nach der Ultrazentrifugation wird das Röhrchen vorsichtig entfernt und eine Fraktion von einem Milliliter in autoklavierte Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt. Die TEM-Analyse zeigte, dass mykobakterielle EVs kreisförmig sind, und die Nano-Tracking-Analyse bestätigte unterschiedlich große EVs mit Durchmessern zwischen 20 und 250 Nanometern.Als das N-terminale Ende von mCherry translational mit dem C-terminalen Ende von CFP-29 fusioniert wurde, färbte sich ein Teil der angereicherten mEVs von Msm rosa, was auf die Fähigkeit von cf-29 hindeutet, ein fremdes Protein von Interesse zu tragen. CFP-29 wurde dann verwendet, um die EsxA-Verabreichung in MSM-Elektrofahrzeuge zu evaluieren. EsxA von Mtb wurde in MSM-Elektrofahrzeugen in geringen Mengen beobachtet.CFP-29 EsxA 3X FLAG war stabiler und akkumulierte in mEVs auf höheren Niveaus. Die Anreicherung der EVs aus Mykobakterien, die unter physiologisch unterschiedlichen Bedingungen gezüchtet wurden, gibt Einblicke in ihre veränderten Inhaltsstoffe und modifizierten Funktionen, die eine anhaltende Infektiosität, Pathogenese und Ausbreitung von Krankheitserregern bestimmen.

Research

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The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

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In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

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The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...