Name: enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

המחברים מודים מקרב לב לפרופ' שרה מ. פורצ'ן על שיתוף המניות של M. smegmatis mc2155. הם גם מכירים ב-Servier Medical Art (smart.servier.com) על כך שהוא מספק כמה אלמנטים בסיסיים עבור איור 1. הם מודים בכנות על תמיכתם של שאר חברי המעבדה בהתאמות המטופלים שלהם במהלך השימוש הממושך בשייקרים של האינקובטור, הצנטריפוגות והאולטרה-צנטריפוגות להעשרת mEV. הם גם מודים למר סורג'יט יאדאב, עוזר המעבדה, על כך שתמיד דאג שכלי הזכוכית והחומרים המתכלים הדרושים יהיו תמיד זמינים ושימושיים. לבסוף, הם מודים לצוותי הניהול, הרכישה והכספים של THSTI על תמיכתם המתמדת ועזרתם בביצוע חלק של הפרויקט.

1. תנאי גדילה של Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli, ונגזרותיהם
<ol><li>מדיה<ol><li>Middlebrook 7H9 מרק נוזלי<ol><li>הכינו תמיסת מלאי 20% Tween-80 על ידי חימום מראש של הנפח הנדרש של מים מזוקקים פעמיים (ddw) בכוס זכוכית ל~45-50 מעלותצלזיוס במיקרוגל, הוסיפו את הנפח הנדרש של Tween-80 באמצעות ...

מאחר שפיתוח חיסון חדשני לשחפת שעדיף על BCG ויכול להחליף אותו נותר אתגר עצום, כחלופה, מספר קבוצות מחפשות גילוי של חיסוני שחפת תת-יחידות שונות שיכולים להגביר את עוצמתו של BCG ולהאריך את משך ההגנה שלו48,49. בהתחשב בתשומת הלב הגוברת לרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) כתת-יח...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

למרות הפיתוח והניהול של מגוון רחב של חיסונים נגד מחלות זיהומיות, אפילו עד עצם היום הזה, ~ 30% מכלל מקרי המוות האנושיים עדיין מתרחשים ממחלות מידבקות1. לפני הופעת החיסון נגד שחפת - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - שחפת הייתה גורם התמותה מספר אחת (~10,000 עד 15,000/100,000 תושבים)2. עם מתן BCG וגישה קלה לתרופות קו ראשון ושני נגד שחפת, עד 2022, מקרי מוות הקשורים לשחפת ירדו באופן דרמטי ל~1 מיליון לשנה עד 2022 (כלומר, ~ 15-20/100,000 אוכלוסייה1). עם זאת, באוכלוסיות אנדמיות לשחפת בעולם, מקרי מוות הקשורים לשחפת ממשיכים לעמוד על ~ 100-550/100,000 אוכלוסייה1. בעוד מומחים מכירים במספר סיבות שהובילו למספרים מוטים אלה, נראה כי הגנה בתיווך BCG שאינה נמשכת אפילו בעשור הראשון לחיים היא הסיבה הבולטת 3,4,5,6,7. כתוצאה מכך, בהתחשב ב"יעדי פיתוח בר-קיימא" המחודשים של האו"ם וב"אסטרטגיית סוף השחפת" של ארגון הבריאות העולמי, ישנו מאמץ עולמי מרוכז לפתח חלופה חיסונית עדיפה בהרבה ל-BCG, שאולי מספקת הגנה לכל החיים מפני שחפת.

לקראת מטרה זו, מספר קבוצות מעריכות כעת זני BCG מותאמים/רקומביננטיים, זנים מיקובקטריאליים לא פתוגניים ומוחלשים שאינם BCG, ומועמדים לתת-יחידות 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . בדרך כלל, חיסונים תת-יחידות הם ליפוזומים הנטענים באופן סלקטיבי עם מעט חלבונים אימונוגניים מטוהרים (~1-6) באורך מלא או קטועים של הפתוגן. עם זאת, בגלל הקיפול המזויף שלהם לקונפורמציות לא ילידיות ו / או אינטראקציות אקראיות לא פונקציונליות בין החלבונים הטעונים, תת-יחידות חסרות לעתים קרובות אפיטופים מקומיים וגרמניים ולכן אינן מצליחות להכשיר מספיק את מערכת החיסון14,19,20.

כתוצאה מכך, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) של חיידקים תפסו תאוצה כחלופה מבטיחה 21,22,23,24,25,26. בדרך כלל, כלי רכב חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של המרכיבים התאיים שלהם, כולל חלקים מסוימים של חומצות גרעין, שומנים ומאות מטבוליטים וחלבונים27,28. שלא כמו ליפוזומים שבהם כמה חלבונים מטוהרים נטענים באופן מלאכותי, bEV מכילים מאות חלבונים טעונים באופן טבעי, מקופלים באופן טבעי עם נטייה טובה יותר להפעיל את מערכת החיסון, במיוחד ללא דחיפה/סיוע של אדג'ובנטים ואגוניסטים לקולטן דמוי אגרה (TLR)27,28,29. בקו מחקר זה אנו ואחרים בחנו את התועלת של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים כמאיצי תת-יחידות פוטנציאליים ל-BCG30. למרות החששות כי bEVs חסרים עומסי אנטיגן אחידים, EVs מ Neisseria meningitidis מוחלש הגנו בהצלחה על בני אדם מפני מנינגוקוק serogroup B31,32.
לפחות תיאורטית, כלי הרכב החשמליים הטובים ביותר שיכולים להגביר היטב את BCG הם כלי הרכב החשמליים המועשרים מחיידקים פתוגניים. עם זאת, העשרת כלי רכב חשמליים הנוצרים על ידי מיקובקטריום פתוגני היא יקרה, גוזלת זמן ומסוכנת. בנוסף, כלי רכב חשמליים שנוצרו על ידי פתוגן עשויים להיות אלימים יותר מאשר מגנים. בהתחשב בסיכונים הפוטנציאליים, כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול בדוק היטב להעשרת כלי רכב חשמליים שנוצר על ידי Msm שגדל באופן אקסני, מיקובקטריום אלים.
עם זאת, למרות קידוד מספר אורתולוגים של חלבונים פתוגניים, מיקובקטריה אלימים חסרים מספר אנטיגנים חיסוניים / אפיטופים של חלבון פתוגני הדרושים כדי להכין מספיק את מערכת החיסון לקראת הגנה33. לכן, בחנו גם בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים רקומביננטיים של MSM באמצעות הנדסה מולקולרית, כך שחלק משמעותי מכל חלבון פתוגני בעל עניין המובע ומתורגם ב-MSM, חייב להגיע לרכבים החשמליים שלו. שיערנו כי אחד או יותר מ-10 החלבונים הנפוצים ביותר של Msm EVs כאשר הם מאוחים לחלבון המעניין יסייעו בטרנסלוקציה כזו.
בזמן שהתחלנו לתקנן את ההעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים (mEVs) במעבדה שלנו, בשנת 2011, Prados-Rosales ועמיתיו דיווחו לראשונה על הדמיה והעשרה של mEV במבחנה30. מאוחר יותר, בשנת 2014, אותה קבוצה פרסמה גרסה שונה של שיטת2011 34. בשנת 2015, Lee et al. דיווחו גם על שיטה סטנדרטית עצמאית להעשרת mEV שוב מתרביות אקסניות של מיקובקטריה35. בשילוב שני הפרוטוקולים34,35 ושילוב כמה מהשינויים שלנו לאחר סטנדרטיזציה יסודית, אנו מתארים כאן פרוטוקול המסייע להעשיר באופן שגרתי mEV מתרביות אקסניות של מיקובקטריה 36.
כאן אנו מפרטים במיוחד את ההעשרה של כלי רכב חשמליים ספציפיים ל-Msm, שהיא הרחבה של פרוטוקול36 שפורסם להעשרת רכבים חשמליים מיקובקטריאליים בכלל. אנו גם מפרטים כיצד לבנות mEV רקומביננטי (R-mEVs) המכילים את חלבון mCherry (ככתב פלואורסצנטי אדום) ואת EsxA (Esat-6)37,38,39, אימונוגן דומיננטי ותת-יחידה פוטנציאלית מחוסנת של Mycobacterium tuberculosis. הפרוטוקול להעשרת ה-R-mEV נותר זהה לזה שתיארנו להעשרת כלי רכב חשמליים מקומיים מ-Msm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A2 type Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>1300 series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench top Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, USA</td>
			<td></td>
			<td>5810 R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstB1, HindIII, HpaI</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell densitometer</td>
			<td>GE Healthcare, USA</td>
			<td></td>
			<td>Ultraspec 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Distilled Water</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EsxA-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Ammonium Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor model centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sorvall RC6 plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>1 L Erlenmeyer flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES and Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shakers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ 6000 &#38; 8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Broth and Agar, Miller</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>Tarsons, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Tarsons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-specific Ab</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>LG, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>MC3286BLT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook ADC enrichment</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Middlebrook ADC enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Spectronic 200 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB5a</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>a derivative of DH5a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep (Iodixanol)</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Available as 60% stock solution (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toledo, USA</td>
			<td></td>
			<td>Mettler Toledo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA mini kit</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>New Series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pMV261</td>
			<td>Addgene, USA * 
			*The&#160;&#160; plasmid&#160;&#160; is&#160;&#160; no&#160;&#160; more available in this plasmid bank</td>
			<td></td>
			<td>Shuttle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Phusion DNA Plus Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Proof-reading DNA Polymerase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated circulating water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>R20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrock 7H11 Agar base</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>BBL Seven H11 Agar base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC broth</td>
			<td>Hi Media, INDIA</td>
			<td></td>
			<td>Hi Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Optima L100K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 14 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polyallomer type &#8211; ultra clear type in SW40Ti rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes - 38 mL</td>
			<td>Beckman Coulter, USA</td>
			<td></td>
			<td>Polypropylene type&#8211; cloudy type for SW28 rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonics cleaning waterbath sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sonicator - bench top model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Disposable filters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-kDa Centricon concentrators</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3X FLAG antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td>Nunc-Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td></td>
			<td>Sterile, pre-packed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli</td>
			<td>NEB, USA</td>
			<td></td>
			<td>NEB 5-alpha (a derivative of DH5&#945;).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::mCherry</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG</td>
			<td>This study</td>
			<td></td>
			<td>MC2&#160;155</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td>
			<td>Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA</td>
			<td></td>
			<td>&#160;MC2&#160;155</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of native and recombinant extracellular vesicles of mycobacteria

רוב החיידקים, כולל מיקובקטריה, מייצרים בועיות חוץ-תאיות (EV). מאחר שרכבים חשמליים חיידקיים (bEVs) מכילים תת-קבוצה של רכיבים תאיים, כולל מטבוליטים, שומנים, חלבונים וחומצות גרעין, מספר קבוצות העריכו את הגרסאות המקוריות או הרקומביננטיות של bEV על עוצמת ההגנה שלהן כמועמדים לחיסון תת-יחידתי. שלא כמו כלי רכב חשמליים מקומיים, כלי רכב חשמליים רקומביננטיים מהונדסים מולקולרית כך שיכילו אימונוגן אחד או יותר בעלי עניין. במהלך העשור האחרון, קבוצות שונות בחנו גישות מגוונות ליצירת bEV רקומביננטי. עם זאת, כאן אנו מדווחים על תכנון, בנייה והעשרה של כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים רקומביננטיים (mEVs) במיקובקטריה. לשם כך, אנו משתמשים ב-Mycobacterium smegmatis (Msm), מיקובקטריום אדמה אלים כמערכת המודל. תחילה נתאר את היצירה וההעשרה של כלי רכב חשמליים מקומיים של Msm. לאחר מכן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של mEV רקומביננטי המכיל mCherry, חלבון כתב פלואורסצנטי אדום, או EsxA (Esat-6), אימונוגן בולט של Mycobacterium tuberculosis. אנו משיגים זאת על ידי מיזוג נפרד של mCherry ו- EsxA N-termini עם C-terminus של חלבון Msm קטן Cfp-29. Cfp-29 הוא אחד החלבונים הבודדים שנמצאים בשפע של MsmEVs. הפרוטוקול ליצירה והעשרה של mEV רקומביננטי מ-Msm נותר זהה ליצירה ולהעשרה של כלי רכב חשמליים מקוריים של Msm.

אנו משתמשים ב-M. smegmatis (Msm) כמודל מיקובקטריום כדי להדגים את ההעשרה של mEV מקומיים ורקומביננטיים (R-mEVs). פרוטוקול העשרה סכמטי זה של mEVs (איור 1) פועל גם להעשרה של R-mEV של Msm ושל כלי רכב חשמליים מקומיים של Mtb (עם שינויים קלים כמו בהערות פרוטוקול של 1.2). הדמיה של כלי רכב חשמליים מועשרי?...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria at JoVE.com

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

פרוטוקול זה מפרט את ההעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מיקובקטריאליות (mEVs) מקוריות מתרביות אקסניות של Mycobacterium smegmatis (Msm) וכיצד ניתן לתכנן ולהעשיר MsmEV רקומביננטי המכיל mCherry (כתב פלואורסצנטי אדום). לבסוף, הוא מאמת את הגישה החדשנית עם העשרה של MsmEV המכילים את חלבון EsxA של Mycobacterium tuberculosis.

העשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות ורקומביננטיות של מיקובקטריה

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

העשרת כלי הרכב החשמליים המיקובקטריאליים מסייעת לשרטט את תכולתם, לפענח את הפלגים שלהם ולתאריכים לתכנון דרכים לבנות ולייצר כלי רכב חשמליים רקומביננטיים המנצלים בעיקר מועמדים לחיסון. שש סדרות נוצרות ממקומות שונים של פני השטח של החיידקים. אין להם סמנים שמורים.לפיכך, כל גישה מבוססת זיקה יכולה להעשיר רק תת-קבוצה של כלי רכב חשמליים. לעומת זאת, השיטה שלנו לוכדת את כל המיקובקטריה החשמליים שנוצרו. מי שידגים את ההליך יהיה מוהד איליאס, דוקטורנט מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, הוסף מיליליטר אחד של מלאי גליצרול של Mycobacterium smegmatis מסוג בר או רקומביננטי לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מרק 7H9 שחומם מראש. סגרו את המכסה וסובבו את הצינור לפני הדגירה על התרבית למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס בין 200 ל-220 סל"ד. למחרת, כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע בערך אחד, צנטריפוגה את התרבית ב 3, 200 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant לתוך מיכל השלכה נוזלי.הוסיפו מיליליטר אחד של מצע Sautons שחומם מראש והשהו מחדש בעדינות לקבלת מתלה אחיד. לפצות את עוצמת הקול עד 10 מיליליטר באמצעות מדיה Sautons. שוב צנטריפוגה והשליך את הסופרנטנט.לאחר שטיפה, להשעות מחדש את תאי החיידקים. ב-20 מיליליטר של מדיה Sautons שחוממה מראש ומודדים את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר. יש לחסן את נפח התרחיף החיידקי הנדרש בבקבוק ארלנמאייר של ליטר אחד או שניים המכיל 330 מיליליטר של מצעי Sautons ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד עד שהצפיפות האופטית מגיעה ל-0.3.למחרת, שטפו את התאים פעם אחת כפי שהודגם קודם לכן והשעו מחדש את הגלולה ב 330 מיליליטר של Sautons המכילים 1/10 Tween 80. מחלקים 50 מיליליטר של תרחיף התא לשש צלוחיות של ליטר אחד, שכל אחת מהן מכילה 280 מיליליטר של סאוטונים שחוממו מראש המכילים 1/10 Tween 80. דוגרים על התרביות ב-37 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד עד שהצפיפות האופטית מגיעה לשתיים עד 2.5.הוסף שני ליטרים של תרביות בשלב הביניים לשישה בקבוקים של 400 מיליליטר וצנטריפוגה ב 8, 000 גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הצלוחיות או הכוסות האוטוקלאביות הסופרנאטנטיות והצוננות מראש ואחסנו אליציטוט של הגלולה להליכים אנליטיים. הגלולה צבועה אם כלי הרכב החשמליים רקומביננטיים עבור mCherry וחומים אם הם מסוג פראי או רקומביננטיים עבור חלבונים שאינם פלואורסצנטיים.סננו את תרבית העל דרך מסנן סילוק של 0.45 מיקרון, ולאחר מכן סיננו דרך מסנן של 0.22 מיקרון כדי להסיר את כל עקבות החיידקים. לאחר מכן, לשטוף מראש את רכזי קרום 30 קילודלטון עם 15 מיליליטר של מים מזוקקים כפול ב 4, 000 גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשטוף עם 15 מיליליטר של מדיה Sautons קר מסונן מראש באמצעות אותם תנאים כדי להסיר את כל עקבות של כימיקלים.לאחר הכביסה, להוסיף 15 מיליליטר של supernatant מתורבת מסונן לתוך רכז ולהתרכז ב 4, 000 גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את התרכיז לצינור צנטריפוגה קר של אוק רידג' בקוטר 40 מ"מ או לצינור צנטריפוגת פלקון טרי בקוטר 50 מיליליטר. לאחר ריכוז כל שני ליטר תסנין התרבית, מעבירים את התרכיז לצינור צנטריפוגת פוליפרופילן 50 מיליליטר מזוקק כפול, שטוף ומצונן מראש ונתון לצנטריפוגה דו-שלבית.תחילה ב 4, 000 G, ולאחר מכן ב 15, 000 G.להעביר את התרכיז צנטריפוגה לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה 38.5 מיליליטר מקורר מראש להסתובב ב 100, 000 G במשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנאטנט בצינור צנטריפוגת פלקון טרי של 50 מיליליטר מקורר מראש. הפוך את צינור האולטרה-צנטריפוגה על נייר סופג טרי ללא סיבים כדי להסיר עקבות של הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-600 מיקרוליטר של חיץ HEPES.הניחו את הגלולה המרחפת בתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה מפוליפרופילן אולטרה-צנטריפוגה מקורר מראש של 13 מיליליטר וערבבו בעדינות עם ארבעה מיליליטר של תמיסת יודיקסנול הדרגתית אינרטית בצפיפות של 60%. לאחר מכן שכבה עם מיליליטר אחד כל אחד של 40%30%, 20% ו 10% של יודיקסנול. מלאו את הצינור על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של 6% יודיקסנול בחלק העליון.לאחר שקילה זהירה של הצינור בכוס זכוכית או מעמד, העבירו אותו בעדינות לדליים המתנדנדים ולאחר מכן לרוטור דליי המתנדנד עבור אולטרה-צנטריפוגה ב 141, 000 גרם למשך 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר אולטרהצנטריפוגה, בזהירות להסיר את הצינור ולאסוף חלק אחד מיליליטר לתוך צינורות microcentrifuge autoclaved. ניתוח TEM הראה כי כלי רכב חשמליים מיקובקטריאליים הם מעגליים וניתוח ננו-מעקב אישר כי כלי רכב חשמליים בגדלים שונים עם קטרים הנעים בין 20 ל-250 ננומטר.כאשר קצה N-terminal של mCherry אוחה באופן תרגומי לקצה C-terminal של CFP-29, חלק מה-mEV המועשר של Msm הפך ורוד, מה שמצביע על יכולתו של cf-29 לשאת חלבון זר בעל עניין. CFP-29 שימש אז להערכת אספקת EsxA לרכבים חשמליים מסוג Msm. EsxA של Mtb נצפה ברכבים חשמליים מסוג Msm בכמויות נמוכות.CFP-29 EsxA 3X FLAG היה יציב יותר והצטבר ברמות גבוהות יותר ב-mEVs. העשרת כלי הרכב החשמליים ממיקובקטריה הגדלים בתנאים פיזיולוגיים שונים מספקת תובנות לגבי התוכן המשתנה שלהם ותפקודים משתנים המכתיבים זיהומיות מתמשכת, פתוגנזה והתפשטות פתוגנים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

ייצור Titering של Adeno הקשורים ווקטורים רקומביננטי ויראלי

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

בידוד של שלפוחית חוץ-תאי של נוזל שטיפה Bronchoalveolar מאתר באמצעות טכניקת צנטריפוגה אולטראפילטרציה

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

דור, הגברה, טיטור של Recombinant וירוסים Syncytial הנשימה

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...